Процедуры гонадэктомии и забора крови в малогабаритной модели Teleost японской медаки (Oryzias latipes)

Этот метод поможет ответить на ключевые вопросы, касающиеся физиологической функции половых желез, в том числе о роли половых стероидов в пластичности и регуляции нейроэндокринной системы у костистых рыб и в большей степени у позвоночных. Этот протокол позволяет выполнять гонадэктомию с высокой частотой успешности при малой модели костистой костистой медеки, что широко используется в научно-исследовательском сообществе. Для того, чтобы быть успешным и достичь высокой выживаемости, эта методика требует надлежащей подготовки, особенно в оценке половых желез и наложении швов на рыб.

Начните с того, что вытащите рыбу из обезболивающего раствора и положите ее горизонтально на бок под микроскопом для вскрытия. Чтобы выполнить овариэктомию у женщин, соскабливают чешуйки в области разреза. Аккуратно сделайте разрез от двух до 2,5 миллиметров между ребрами и брюшными и анальными плавниками с помощью лезвия бритвы.

Аккуратно ущипните брюшко рыбы, одновременно вынимая яичники с помощью тонких щипцов с широким кончиком. Важно избегать перелома ребер, которые могут стать причиной летального исхода. Разрежьте концы яичников тонкими щипцами и отложите их в сторону.

Чтобы выполнить орхидэктомию у самцов, сделайте разрез между ребрами над анальным отверстием и медленно вскрывайте разрез с помощью тонких щипцов. Аккуратно захватите яички щипцами и медленно выньте их. Затем обрежьте конец семенников, чтобы полностью удалить их.

После выполнения процедуры зашить разрез одинаково для мужчин и женщин. Поместите нейлоновую нить рядом с областью разреза и проколите кожу с правой стороны разреза через внутреннюю полость тела, используя ультратонкие щипцы для введения нити. Затем проколите кожу с левой стороны разреза через внешнюю полость тела, чтобы извлечь нить.

Закройте отверстие для разреза, завяжите два узла, а лишнюю нить обрежьте. Поместите рыб в изотоническую восстановительную воду и оставьте их там как минимум на 24 часа, прежде чем переместить их в аквариумную систему. Соберите ящик для крови, прикрепив стеклянную иглу к силиконовому капилляру.

Сломайте кончик иглы щипцами с широким концом и обмажьте внутреннюю часть иглы раствором антикоагулянта путем отсасывания и обдува. Направьте иглу к области плодоножки рыбы, нацелившись на хвостовую вену стебля, и втягивайте кровь ртом, пока не заполнится хотя бы 1/4 от общего объема иглы. Отпустите иглу и приложите кусочек скотча рядом с острой стороной.

Наденьте на сборную трубку крышку с отверстием и вставьте иглу внутрь трубки через отверстие кончиком иглы снаружи. Поместите рыб в восстановительную воду и оставьте их там минимум на 24 часа, прежде чем переносить их в аквариумную систему. Вспышкой вращайте кровь в течение одной-двух секунд со скоростью 1000 G, чтобы собрать кровь в пробирку.

Выживаемость после овариэктомии, или OVX, у самок составила 100%, а у самцов после орхидэктомии – 94%. Все рыбы пережили процедуру забора крови. У самок, прооперированных обманом, наблюдалось положение OV.

Все яйцеклетки были оплодотворены и приступили к эмбриональному развитию. Когда процедура гонадэктомии была выполнена правильно, форма тела рыб немного изменилась, и кусочков гонады не осталось. Разрез и шов полностью исчезли через четыре недели после гонадэктомии.

Через четыре месяца все рыбы по-прежнему демонстрировали здоровый фенотип, и не было обнаружено никакой гонадной ткани. Анализ крови у самок показал, что уровень E2 у рыб OVX был значительно ниже, чем у рыб, прооперированных обманом, через 24 часа после операции. По прошествии четырех месяцев уровень Е2 в рыбе OVX все еще был значительно ниже, чем в рыбах, выращенных на искусственной основе.

Частично OVX-рыбы, у которых было удалено только от 1/3 до 1/2 гонады, показали значительно более низкие уровни E2, чем у фиктивных рыб, и значительно более высокие уровни E2, чем у полностью OVX-рыб. Концентрация 11-KT у самцов, подвергшихся орхидэктомии, была значительно ниже, чем у искусственно прооперированных рыб через 24 часа после операции. Через четыре месяца уровень 11-КТ все еще был ниже, чем у рыбы, выращенной на фиктивной основе.

Частично орхидэктомированная рыба показала более низкие уровни 11-KT, чем рыбы, обработанные фиктивно, и более высокие уровни, чем полностью орхидэктомированные рыбы. Чтобы процедура прошла успешно, важно удалить гонаду как можно аккуратнее и полностью, не повредив другие органы внутри рыбы. Поскольку известно, что половые стероиды играют важную роль в пластичности клеток мозга и гипофиза, этот метод является мощным инструментом для исследования основных механизмов в небольших моделях костистых рыб.