Лазерная доплеровский перфузионной визуализации в мыши Hindlimb

Язва кожи при недостаточном заживлении ран является основной причиной ампутации у пациентов. Адекватное заживление ран требует более высокого уровня артериального изобилия, которые необходимы для поддержания нетронутой кожи, которая скомпрометирована у пациентов с периферической артериальной болезнью. Несколько других ревматологических состояний и диабета может также привести к нарушенной и неадекватной микроциркуляции кожи, чтобы залечить раны.

Многие больные сахарным диабетом имеют сопутствующие периферические артериальные заболевания, что ставит их на особенно высокий риск ампутации. Лазерная доплеровской визуализации перфузии или LDPI используется в клинических ситуациях для оценки микроциркуляции кожи, а также в научно-исследовательских ситуациях для оценки кровотока и восстановления кровотока после экспериментальной ишемии хиндлимба, ишемии реперфузии и микрохирургических закрылков. Система LDPI проецирует малоэнездкую лазерный луч, который отклоняется сканирующее зеркало для перемещения по области, представляющие интерес.

Это отличается от лазерной доплеровского потокаметрии, которая обеспечивает измерение перфузии для небольшой площади ткани в непосредственном контакте с зондом flowmetry. Когда лазерный луч взаимодействует с двигающейся кровью в микроваскулатуре, он подвергается сдвигу частоты Доплера, который фотодехтируется сканером и преобразуется в произвольные единицы перфузии. Поскольку LDPI является световой техникой, он ограничен по глубине проникновения до 0,3-1 миллиметра, что означает, что по большей части оценивается дермальная перфузия.

Кожный поток может быть изменен температурой кожи и симпатической нервной системой, на которую могут повлиять различные анестетические средства. Измерения от оптического лазера также повлияны на условиями окружающего освещения, пигментацией кожи и могут быть прегражены overlying мехом или волосами. LDPI является наиболее часто используемым методом исследования для мониторинга восстановления изобилия после ишемии, потому что он неинвазивный, не требует контрастного введения, и имеет быстрое время сканирования, позволяющее сбор данных о нескольких животных.

Это делает его идеальным, чтобы помочь определить, являются ли методы лечения, направленные на терапевтический артериогенез или ангиогенез являются эффективными в малых животных моделей. Восстановление кровотока после ишемии хиндлимбой, измеряемой LDPI, хорошо коррелирует с развитием сопутствующих артерий при оценке другими средствами, такими как литье микрозаполненных или микроКТ. Цель этого протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать оценку перфузии хиндлимба с помощью LDPI. Отрегулируйте высоту сканера так, чтобы расстояние до предмета сканирования составило около 30 сантиметров.

Включите изображение и запустите связанное с ним программное обеспечение. Откройте программу измерений. Если программное обеспечение правильно общается со сканером, появится инфракрасный лазерный поворот на предупреждение.

Отрегулируйте настройки сканера, чтобы быть подходящими для фонового материала и установки освещения в комнате. Установите фоновый порог, указав лазерный луч на черный фоновый материал и нажмите Auto BK Set. Настройка изофлюрановой индукционной камеры с соответствующей очисткой ототголого газа.

Размещение индукционной камеры на нагреваемой площадке поможет предотвратить потерю температуры мыши во время индукции анестезии. Включите гомеотермическое одеяло, которое помещается в зону сканирования под неотражающей поверхностью. В этом случае черная неопреновая ткань.

Гомеотермическое одеяло установлено для поддержания температуры тела 37 градусов по Цельсию. Распоитите температурный зонд и смазочные материалы, чтобы они были готовы к вставке. Поместите анестезию маски для лица и очистки системы в области сканирования, а также.

Обезболивать мышь испарителем изофлюрана. Скорость кислорода устанавливается до одного литра в минуту потока. А изофлюран регулируется до 4% для индукции анестезии.

Поток включен в индукционной камере анестезии и скорость дыхания мыши будет замедляться. Адекватная анестезия достигается, когда мышь теряет свой правильный рефлекс. Передача мыши в анестезирующей маске нос конуса с прилагается мусорщика отходов газа и настроить изофлюран до 1,5%Этот уровень анестезии, как правило, достаточно, чтобы держать мышь лежала относительно еще во время сканирования, но не предназначен для обеспечения хирургического уровня анестезии.

Таким образом, глубина анестезии не проверяется. Изменение уровня изофлюрана вызывает изменения в сердечном ритме, дыхании и дермальных изобилиях. Таким образом, последовательный процент должен использоваться на протяжении всего эксперимента курса времени и для всех экспериментальных субъектов.

Альтернативные анестетические методы, такие как инъекция ИС кетамина ксилазина также могут быть использованы, но тот же анестетический метод должен быть использован на протяжении любого исследования курса времени, как различные анестетики влияют на дермальное изобилие по-разному. Если область плана, интересная для сканирования, покрыта мехом, используйте небольшой электрический триммер и/или крем для удаления волос из области интереса. Депиляативные кремы должны быть полностью удалены и кожи мыши высохли до сканирования, как мокрая кожа может вызвать отражения от лазерного Вставить смазанной ректальной температуры зонда, связанного с гомеотермическим одеялом в прямой кишке мыши.

Equilibrate температуры мыши желание сканирования температуры, 37 градусов по Цельсию. Это может занять до 5-10 минут. Выберите настройку сканера, доступ к которой можно получить из верхнего меню или из значка Scanner Setup.

Область сканирования должна быть скорректирована путем изменения координат X, Y с учетом области интересов. Скорость сканирования будет зависеть от разрешения сканирования. Более высокое разрешение приведет к более длительное время сканирования.

Для повторного сканирования, сосредоточения внимания на глобальном изобилии, в отличие от более высокого разрешения, фокусированного на анатомические перфузии, самая высокая скорость сканирования в четыре миллисекунды на пиксель является адекватной. При выполнении повторных сканирований выберите вкладку Repeat and Line Scan. Количество сканирований может быть изменено.

В этом случае три сканирования, а также интервал повторения. Минимальным временем для интервала повторения будет предполагаемое время сканирования, показанное в серой области справа от коробки, определяемое областью сканирования и разрешением сканирования. Добавление нескольких секунд позволяет пользователю приостановить и потенциально переместить мышь, если это необходимо между сканированием.

Общее время сканирования в этом случае составляет три минуты и 21 секунду. Выберите вкладку «Сканирование изображений» и выберите кнопку «Марк». Это приведет к тому, что лазер наметит область сканирования.

Отрегулируйте положение мыши так, чтобы цель, которую нужно отсканировать, была в пределах отмеченной области. Начните повторное измерение, выбрав значок повторного сканирования и нажав кнопку Воспроизведение, чтобы инициировать сканирование. Появится всплывающее окно, подтверждающее расстояние сканирования.

Нажмите OK, чтобы начать сканирование. Начальное сканирование мыши до индукции ишемии хиндлимбой показано в режиме реального времени. Второе и третье повторные сканы ускоряются до 16-й скорости.

Основное окно показывает результаты сканирования, так как оно генерируется программным обеспечением. Вставка в правом нижнем углу показывает лазерное сканирование мышей подножки. Для сканирования подножки или подножки и спинного теленка, склонные позиционирования с задними конечностями, вытянутой к хвосту обеспечивает более последовательную область интереса в позиционировании на спине.

Бедренная артерия, сафенозная артерия и коллатеры очень близки к брюшной поверхности бедра и теленка. Таким образом, позиционирование на спине является предпочтительным при использовании этих регионов, представляющих интерес. Мониторинг мыши во время сканирования движения мыши.

Если мышь движется достаточно, что подножки больше не находятся в области сканирования в середине сканирования, перезапустите сканирование. Небольшие изменения в положении подножка мыши могут быть размещены для анализа программного обеспечения. Кроме того, контролировать температуру мыши во время процесса сканирования, как она может колебаться даже с использованием гомеотермического одеяла.

Если температура мыши слишком сильно разная, это может привести к значительным различиям между сканированием. Как правило, температурный диапазон от 36,8 до 37,2 приведет к приемлемым данным. Сохраните захваченное сканирование под окном Save As с именем файла, которое включает идентификатор мыши и точку времени для облегчения анализа данных.

Введите мышь и детали точки времени при желании в окне Детали темы. Вентраль заднее сканирование с помощью мыши в положении на спине показано здесь после корректировки области сканирования. Обратите внимание, что предложение с мышью на спине приводит к переменной части стороны ноги сканируется.

Удалите зонд прямой температуры и дезинфицировать его с 70% этанола, чтобы он был готов к следующей мыши. Снижение изофлюрана до 0%Мышь будет восстанавливаться быстрее, если она продолжает получать кислород, но она также может быть восстановлена без дополнительного кислорода. Позвольте мыши оправиться от анестезии до точки, где она отображает правильный рефлекс, листая из положения на спине в положение лежа перед возвращением его в клетку.

Восстановление может быть осуществлено либо на согревающий одеяло для изофлуран, так как восстановление очень быстро или в теплой клетке восстановления кетамина ксилазина. Откройте программу обзора изображений. Откроется новое окно для просмотра сканирований.

Перейдите в меню File, откройте и найдите сохраненный файл. Выберите значок roi из панели инструментов. Выберите значок Добавить полигон.

Отслеживайте область вокруг области, представляющие интерес, используя мышь. После завершения работы вернитесь к панели инструментов и выберите значок Статистики. Это позволит получить окно, показывающее статистические данные по региону, представляющим интерес.

При анализе данных среднее единица изобилия, или PU, значения не меняются более чем от 100 до 150 PUs в течение повторного сканирования для каждой подножки. Это приемлемое сканирование и указывает на то, что мышь была хорошо уравновешена во время сканирования. Средние значения PU с вариацией от 100 до 150 PUs, что соответствует более чем 10% от среднего перфузии для неунимной коврик для ног мыши над повторным сканированием, указывают на то, что мышь не была хорошо уравновешена и сильно рекомендуется повторное сканирование.

Выполнение быстрого анализа сразу после завершения сканирования позволяет повторное сканирование будет выполнено в то время как мышь по-прежнему анестезируется и избежать потери точки данных, которые могут произойти, если сканирование анализируется на более поздний срок и сканирование считается неприемлемым из-за значительных различий между повторными сканирования. Результаты выражаются как соотношение хирургического изобилия хиндлимба над перфузией задней части задней части, как мыши первоначально вазодилатата, а затем развивать свои внутренние залоги, восстановление кровотока по LDPI следует рассматривать в течение послеоперационного времени курса. Степень восстановления зависит от напряжения мыши и тяжести модели ишемии заднего конечности.

Эта цифра показывает завершенный эксперимент курса времени в течение 28 дней, где LDPI был использован для измерения восстановления кровотока ног с течением времени после перевязки бедренной артерии и P27 нокаутом и диким типом C57Bl/6 мышей. Оба P27 нокаутом у диких мышей типа были нарушены восстановления кровотока при лечении с устной доксициклин, обобщенный ингибитор матрицы металлопротеинов, предполагая, что активность MMP облегчает артериогенез. Настройка усиления и фоновый порог должны оставаться неизменными в течение всего эксперимента курса времени.

Если фоновый порог установлен слишком низко, сканирование фонового материала приведет к низким значениям изобилия. Это приведет к тому, что фоновые значения изобилия будут усреднены в область интереса при отборе полигонов. Чтобы устранить эту проблему, фоновый порог можно настроить в окне настройки сканера под общей вкладкой.

В этом случае увеличение фонового порога до 118 единиц изобилия приводит к серому фону, который не будет включен ни в один анализ. Палитра или цветовая шкала для изображения потока может быть скорректирована как в программном обеспечении для измерения, так и в программном обеспечении для обзора изображений. Все значения изобилия, более высокие, чем максимальное значение на шкале, будут отображаться как самый высокий цвет изобилия.

В этом случае, красный. Увеличение динамического диапазона, например, изменение шкалы в диапазоне от нуля до 1500, сделает повторное сканирование изменения более очевидным для глаз, как области измерения от 1000 до 1500 единиц изобилия теперь будут отображаться с использованием градиента цвета, а не все отображается как красный. Сканирование показано здесь было получено в мыши, чья температура тела ядра была первоначально ниже 36,8 в начале повторного сканирования, а затем увеличилось в течение повторных сканирований.

Обратите внимание, что контрольная подножка среднего изобилия была в большей мере осуществляется более холодной температуры тела ядра, чем ишемическая подножка. Одно сканирование более прохладной температуры тела привело бы к более высокому соотношению изобилия, зарегистрированного для этой точки данных. Вариации пигментации кожи мыши, такие как можно увидеть с C57Bl/6 мышей, может привести к области сканирования ниже фонового порогового значения, что сделает анализ регионов, представляющих интерес, содержащих пигментированные области трудно.

Коврики для ног мыши в целом не имеют гиперпигментации, что делает эту область наиболее удобной для сканирования для этого штамма мыши. Если исследователь хочет изучить брюшной задний, то белый штамм мыши должны быть выбраны. LDPI является эффективным, легко выполняется, и повторяемый метод для измерения заднего дерева дермального изобилия как отражение общей артериальной перфузии.

При использовании LDPI для получения достоверных данных требуется последовательная техника.