Изготовление магнитных платформ для микрон-масштабной организации взаимосвязанных нейронов

Наш подход позволяет контролировать формирование нейронных сетей с помощью магнитных манипуляций. Это эффективный инструмент для исследований сетей in vitro и предлагает новое терапевтическое направление для устройств биосовместивания. С помощью этого метода мы можем контролировать как местоположение, так и рост ячейки в микроновом масштабе, что позволяет гибко проектировать магнитную картину и, следовательно, организацию сети.

Эффективная и нетоксичная магнитная наночастица стерилоптика имеет решающее значение. Чтобы добиться успеха, необходимы соответствующие магнитные наночастицы. Важными особенностями являются размер, покрытие и величина намагниченности положения.

Демонстрировать процедуры будут Реут Плен и Дафна Левенберг, магистранты моей лаборатории. Для начала разрежьте стеклянные слайды на две на два сантиметра с помощью писцовой ручки. Очистите стекло ацетоном, а затем изопропанолом в течение пяти минут каждый в ультразвуковой ванне.

Затем высушите их азотом сверхвысокой чистоты. Покрывать стекло фоторезистом с помощью спинового покрытия при 6 000 об/мин в течение 60 секунд для достижения толщины 1,5 микрометра и выпекать 100 градусов Цельсия в течение 60 секунд. Подвергайте образец источнику света с помощью фотомаски или литографии без маски для достижения желаемого рисунка.

Разрабатывайте образец в течение 40 секунд в разбавленом в дистиллированной воде в соответствии с инструкциями производителя. Затем промыть его в воде в течение 45 секунд и высушить газообразным азотом UHP. Осмотрите рисунок под оптическим микроскопом.

Вставьте образец в камеру блокировки нагрузки системы осаждения и дождитесь давления основания. Перенесите образец в основную камеру и установите образец на соответствующую высоту для осаждения. Увеличивайте мощность на каждой цели до тех пор, пока не будет достигнута желаемая скорость.

Включите вращение, затем нанесите ферромагнитный многослойный, чередуя кобальтовые, железные и палладиевые мишени, открывая и закрывая целевые затворы соответственно. Нанесите 14 бислоев кобальтового железа палладия и завершите дополнительным палладиевым укупорочной слоем. После завершения осаждения выгрузите образец из системы осаждения.

Замочите образец в ацетоне на 30 минут и промойте его изопропанолом. Затем высушите его азотом UHP и осмотрите под микроскопом. Храните его в чистой и сухой среде до использования.

Используйте стеклянную горку с крестообразным магнитным стержнями шириной 100 микрометров, нанесенным ферромагнитными многослойными. Прикрепите образец к держателю с помощью двусторонней ленты. Используйте проволочный склеиватель, чтобы приклеить четыре провода к образцу, по одному на каждой ножке поперечного электрода.

Установите держатель образца и образец внутри транспортной измерительной системы с магнитным полем таким образом, чтобы магнитное поле было перпендикулярно образцу. Выполняйте измерения поперечного напряжения, как описано в тексте рукописи. Развергайте магнитное поле и измеряйте поперечное напряжение как функцию поля.

Построение поперечного сопротивления в зависимости от магнитного поля для определения аномального сигнала Холла, который пропорционален перпендикулярной намагниченности в пленке. Подготовьте основную питательную среду и дифференцировочную среду для клеточной культуры PC12, как описано в текстовой рукописи. Выращивайте клетки в необработанной культуральная колба с 10 миллилитрами основной питательной среды, добавляя в колбу 10 миллилитров среды каждые два-три дня.

Субкультура клеток через восемь дней. Для клеточного поглощения центрифугируют клеточную суспензию в течение восьми минут при 200 G и комнатной температуре, затем выбрасывают супернатант. Повторно суспендирует клетки в трех миллилитрах свежей основной питательной среды.

Центрифугируют клетки снова в течение пяти минут, затем отбрасывают супернатант и повторно суспендируют клетки в трех миллилитрах свежей дифференцированной среды. Аспирировать клетки 10 раз, используя шприц и иглу, чтобы разбить кластеры клеток, затем подсчитать клетки с помощью гемоцитометра и посеять один миллион клеток в обычную 35-миллиметровую чашку без полотна. Добавьте в блюдо расчетный объем суспензии MNP и дифференцировки для достижения желаемой концентрации MNP.

Смешайте клетки, MNPs и дифференцировочную среду, затем инкубируют блюдо в 5% увлажненный инкубатор углекислого газа при 37 градусах Цельсия в течение 24 часов. Очистите узорчатый субстрат 70% этанолом и поместите его в 35-миллиметровую культурную посуду в вытяжке. Поместите большой магнит под узорчатую подложку на одну минуту, затем извлеките его, переместив тарелку вверх и прочь и выньв магнит из вытяжки.

Включите ультрафиолет на 15 минут. Чтобы приготовить стеклянную подложку с коллагеновым покрытием, разбавьте коллаген типа один в соотношении один к 50 в 30% этаноле. Накройте стакан раствором.

Оставьте посуду непокрытой в вытяжке на четыре часа, пока весь раствор не испарится, затем трижды вымойте ее в стерильном PBS. Извлеките клетки из инкубатора, центрифугируют клеточную суспензию в течение пяти минут при 200 Г и выбрасывают супернатант. Повторно суспендируют клетки в одном миллилитрах свежей дифференцированной среды и подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра.

Посейте 10 до пяти клеток поверх субстрата в 35-миллиметровую культурную чашку и добавьте два миллилитра дифференцировочной среды. Инкубируют культуру в 5% увлажненный инкубатор углекислого газа при 37 градусах Цельсия. Через 24 часа добавьте в клетки от одного до 100 свежих мышиных бета-NGF.

Обновляйте дифференцировочную среду и добавляйте свежий бета-NGF каждые два дня. Визуляйте клетки каждые два дня с помощью световой микроскопии и выполняйте иммуноокрашивание клеток после формирования сети. Были изготовлены магнитные платформы с различными геометрическими формами и синтезированы флуоресцентные МП оксида железа путем нуклеации.

Магнитометрические измерения MNPs показывают, что кривая намагниченности не имела гистерезиса, низкого поля насыщения и относительно высокой насыщенности намагниченности. Клетки PC12 инкубировали в среде, смешанной с флуоресцентными MNPs оксида железа, превращая их в магнитные единицы. МНПцы были интернализированы в соме клеток, но не в ядрах.

Концентрация железа внутри клеток увеличивалась с увеличением концентрации MNP в среде. Жизнеспособность нагруженных MNP клеток PC12 для различных концентраций MNP оценивали путем сравнения морфологических параметров нагруженных MNP клеток с использованием анализа Shoal, не показывающего отличий от контрольных клеток. Анализы на основе XTT и resazurin подтвердили, что оцененные концентрации MNPs не показали значительной цитотоксичности по отношению к клеткам.

Клетки PC12 с обработкой MNP и без нее выращивали и дифференцировали на магнитной подложке. Было обнаружено, что намагниченные клетки прикрепляются к магнитным паттернам и выращивают ветви в соответствии с паттернами, в то время как клетки без обработки MNP росли без сродства к магнитным устройствам. Здесь показано позиционирование ячеек на подложке с гексагональной геометрией.

75% тел нагруженных ячеек MNP контактировали с магнитными полосами, тогда как только 35% ненамагниченных ячеек были расположены на полосах. В дополнение к эффекту позиционирования клеток, было обнаружено, что эти магнитные платформы контролируют направленность растущих нейритов. Для оценки магнитного влияния на направленность роста нейронов измеряли угол между нейритами и магнитными полосами, показывая значительную корреляцию с ориентацией магнитных полос.

Эта процедура легко адаптируется для направления активных соединений, таких как лекарства, после сопряжения их с магнитными наночастицами. Это может быть переведено на высокопроизводительный скрининг лекарств или местное лечение в тканях. Этот новый подход открывает новые возможности для функционализации других подложек или устройств путем добавления магнитных притягивающих структур.

В настоящее время мы разрабатываем улучшенные биосовместимые интерфейсы нейронных чипов.