Маркировка и визуализация продуктов экспрессии митохондриального генома в хлебобулочных saccharomyces cerevisiae
April 11th, 2021
Дрожжи Бейкера митохондриального генома кодирует восемь полипептидов. Цель текущего протокола состоит в том, чтобы обозначить все из них, а затем визуализировать их как отдельные полосы.
Митохондрии являются важными органеллами эукариотических клеток, способных к аэробной дыхания. Их дисфункция является хорошо известным источником человеческих заболеваний. Дрожжевые митохондрии Бейкера содержат круговой геном, кодирующий восемь белков.
В этом видео мы описали протокол, используемый для анализа биосинтеза белка в дрожжевых митохондриях с помощью радиоактивной маркировки переводческих продуктов и последующего разделения гель-электрофорезом. Процедура включает в себя несколько основных шагов. Полоса дрожжей из замороженных фондовых культур на свежих тарелках с соответствующей среде.
Положите тарелки в инкубатор культуры при 30 градусах в течение 24 до 48 часов. Привить эти культуры в двух миллилитров среды из свежей полосы в 15 миллилитров трубки и инкубировать их ночь агитации при 200 об /мин при 30 градусах. Измерьте оптическую плотность культуры на длине волны 600 нанометров.
Возьмите объем, соответствующий 0,2 абсорбции единиц в стерильных трубках Палитра дрожжевых клеток на 9000 G в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от этого супернатанта. Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд.
Паллетт дрожжевых клеток при температуре 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта. Разбавить клетки в двух миллилитров свежей протрите агар среды.
Инкубационный край, принятый при 200 об/мин и 30 градусах, пока оптическая плотность не достигнет от 1,5 до 1,9 от 1,5 до 1,9 значения. Передача объема культуры, эквивалентного одному оптическому блоку в микро центрифуге трубки. Спин трубки при 3000 G в течение одной минуты.
Откажитесь от супернатанта. Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд. Паллетт дрожжевых клеток на 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре отбросить супернатант.
Повторно приостанавливать дрожжевые клетки в 0,5 миллилитров стерильного буфера перевода. Поместите подвеску в 15 миллилитровую трубку. Добавьте циклохексимид к клеточной суспензии до конечной концентрации 0,2 миллиграмма на миллилитр инкубации в течение пяти минут края, принятых при 200 об/мин и 30 градусов для ингибирования цитозолического перевода.
Добавить от 25 до 30 Добавить от 25 до 30 микрокурит S35 methionine S35 метамфетамина в клеточной подвески и инкубировать в течение 30 минут края при 200 об /мин и 30 градусов. Добавить неоцеливый холодный метионин и боримицин, чтобы остановить маркировку инкубации в течение 10 минут края при 200 об/мин и 30 градусов. Соберите дрожжевые клетки путем центрифугации при 9000 Г в течение 30 секунд.
Вымойте клетки с 0,5 миллилитров стерильной воды вихрем в течение пяти секунд. Паллетт дрожжевых клеток при температуре 9000 Г в течение 30 секунд при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта.
Добавьте 75 микролитров буфера лиза в палитру и вихрь в течение пяти-десяти секунд. Добавьте 500 микролитров буфера 0,5 молярных трисов буфера 0,5 моларных три с рН 6,8. С рН 6,8.
Вортекс кратко. Добавьте в образец 600 микролитров метанола. Вихрь в течение пяти секунд.
Добавьте в образец 150 микролитров хлороформа. Вихрь в течение пяти секунд. Центрифуга образцов в течение двух минут в 12 000 Г. Осторожно отбросьте опафас с помощью пробоя.
Добавьте в образец 600 микролитров метанола. Тщательно перемешайте трубку несколько раз. Образцы центрифуг в течение двух минут при 12 000 Г.Отброс супернатантов.
Воздух высушит паллету в течение двух минут при 80 градусах. Растворите осажденные белки в 60 микролитров буфера образца Laemmli. Нагрейте образцы в течение 10 минут при температуре 14 градусов.
Причина 17,5%Laemmli SDS полиакриламид гель. Загрузите 15 микролитров каждого образца в карманы. Запустите гель в холодной комнате, пока синий краситель достигает примерно 65% гель лимфы.
Пятно гель с Kumasi блестящий синий и сделать сканирование или фото, которое требуется в качестве управления загрузкой. Высушите гель в фене. Храните его в кассете с экраном фосфора хранения в течение трех-пяти дней.
Сканирование экрана на фосфоре изображения. Следуя описанной выше протоколу, мы назначили продукты митохондриального перевода из двух штаммов Saccharomyces cerevisiae. Дикий тип и мутант вариант удаления гена Aim23 кодирования митохондриального перевода инициации фактор три.
Продукты митохондриального перевода уже активно маркированы и разделены в денатурированном полиакриламинидированном геле. Образцы были собраны каждые две с половиной минуты до насыщения, чтобы построить курс времени. Гель был окрашен, высушен и показан после пятидневной экспозиции.
В случае успешного эксперимента на рисунке демонстрируется восемь полос, назначенных в соответствии со стандартным шаблоном. Тем не менее, интенсивности отдельных полос может быть весьма переменной в зависимости от напряжения и экспериментальных условий. Каждая группа соответствует одному переводу продукта.
Данные свидетельствуют о том, что штамм мутантов способен синтезировать митохондриальный белок, потому что все продукты, появляющиеся в диком типе, видны в этом мутанте. Тем не менее, интенсивности полос отличаются от дикого типа, а это означает, что это удаление Aim23 влияет на экспрессию митохондриального гена. Кумаси варится в синем пятно и служит в качестве контроля погрузки.
Их результат в данных может быть количественно определить различия между штаммами или экспериментальных условий с помощью изображения G или изображения Куан программного обеспечения. Для них рассчитывается отношение сигнала, соответствующего каждому продукту, к общему сигналу. Средние значения и стандартные отклонения рассчитываются по крайней мере в трех независимых экспериментах.
Кинетики синтезированного белка перевернулся изучается в эксперименте в прошлом году. Образцы собираются в указанных точках времени после того, как реакция маркировки останавливается холодным метионином и боримицином. Этот контроль необходим для оценки стабильности продукта.
Иммуно-окрашивание с Антителами Anti-Porin одно будет управлением нагрузки. Мы описали метод, который часто используется для изучения биосинтеза белка в дрожжевых митохондриях. Этот протокол относительно прост и быстр в работе.
В то же время, это позволяет получить ценную информацию о скорости перевода четырех дрожжей митохондриальных мРНК, что весьма выгодно. Тем не менее, он имеет ряд ограничений, требующих дополнительных экспериментов и лежит в этом межгосударственном уровне белков и мРНК. Он может предоставить информацию об этих функциях в митохондриальной системе перевода, но для обнаружения механизма следует использовать более продвинутые методы.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье описан протокол маркировки и визуализации восьми полипептидов, закодированных митохондриальным геном дрожжей Baker. Метод включает радиоактивное маркирование продуктов трансляции с последующим использованием гель-электрофореза.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Фон
- Митохондрии играют важную роль в аэробном дыхании в эукариотических клетках.
- Дисфункция митохондрий связана с различными человеческими заболеваниями.
- У дрожжей Baker митохондриальный геном имеет круговую форму.
- Этот геном кодирует восемь необходимых белков.
Цель исследования
- Маркировка всех полипептидов, закодированных митохондриальным геном дрожжей.
- Визуализация этих полипептидов как отдельных полос.
- Улучшение понимания синтеза митохондриальных белков.
Используемые методы
- Радиоактивное маркирование продуктов трансляции.
- Разделение маркированных белков с помощью гель-электрофореза.
- Высеивание дрожжей из замороженных культур на свежие пластинки.
- Использование подходящей среды для роста дрожжей.
Основные результаты
- Успешная маркировка всех восьми митохондриальных полипептидов.
- Визуализация полипептидов как отдельных полос на геле.
- Демонстрация эффективности протокола в анализах синтеза белков.
- Знания о функциях митохондрий и синтезе белков.
Выводы
- Протокол эффективно маркирует и визуализирует митохондриальные белки.
- Этот метод может быть применен в дальнейших исследованиях функций митохондрий.
- Понимание этих процессов важно для решения проблем, связанных с митохондриальными заболеваниями.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Quantitative labeling and visualization of mitochondrial translation products in Saccharomyces cerevisiae enables precise interrogation of mitochondrial gene expression and protein biosynthesis. This capability is critical for mechanistic de-risking in early discovery, particularly when evaluating the impact of genetic perturbations on organellar function. The method supports portfolio decisions by providing robust, comparative data on mitochondrial translation across wild-type and mutant strains.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of mitochondrial translation rates for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing effects of genetic modifications on mitochondrial protein synthesis.
- Facilitates comparative analysis between wild-type and mutant strains to clarify pathway dependencies.
Screening & Assay Development
- Provides a validated workflow for isolating and quantifying mitochondrial translation products.
- Delivers reproducible, quantitative banding patterns for assay standardization and downstream screening.
- Enables reliable detection of biosynthetic defects for compound or genetic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial translation outputs with disease-relevant models when mitochondrial dysfunction is implicated.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by enabling quantitative assessment of mitochondrial gene expression.
- Provides mechanistic insight into translation defects relevant to mitochondrial pathobiology.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical model validation, where mitochondrial function is a key readout.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying translation of mitochondrial-encoded proteins under different genetic backgrounds.
- Screening: Offers reproducible, quantitative outputs for comparing biosynthetic rates across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of band intensities to compare translation efficiency and stability.
- Translational Research: Connects mitochondrial translation data to disease-relevant phenotypes in yeast models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mitochondrial translation analysis across multiple genetic or pharmacological interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mitochondrial target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible workflows for mitochondrial translation analysis.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, comparative data on mitochondrial biosynthesis.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on mitochondrial translation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast genetics, radiolabeling, and protein electrophoresis.
- Needs access to phosphorimaging and quantitative gel analysis infrastructure.
- Demands rigorous controls and replication to ensure data reliability and cross-team comparability.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for translation specificity.
- Interpretation of translation rates must consider additional experiments for mechanistic conclusions.
