Использование иммунофлуоресценции для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в сердцах эмбрионов рыбок данио
15 февраля 2021 г.
Этот протокол использует иммунофлуоресцентный анализ для обнаружения повреждения ДНК, вызванногоPM 2,5,в рассеченных сердцах эмбрионов рыбок данио.
Этот метод может быть использован для точного и легкого обнаружения экспрессии целевых белков в сердце рыбок данио. Изменения в белке-мишени непосредственно обнаруживаются путем измерения иммунофлуоресценции. Выполняют сбор и обработку эмбрионов рыбок данио, как описано в тексте рукописи.
Через 72 часа после оплодотворения перенесите эмбрионы на стеклянные слайды и наблюдайте за ними под стереомикроскопом. Регистрировать пороки развития сердца, такие как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер. Рассчитайте частоту пороков развития и проанализируйте различия между группами, используя один способ ANOVA, а затем многократный сравнительный тест Турции.
После обезболивания эмбрионов 0,6 миллиграмма на миллилитр MS222, записывайте сердцебиение в течение 30 секунд и количественно оцените частоту сердечных сокращений с помощью программного обеспечения Image J. Тщательно рассекните сердца от эмбрионов рыбок данио с помощью одноразовой шприцевой иглы под стереомикроскопом. Используйте гидрофобную барьерную ручку, чтобы нарисовать круг на чистом стеклянном слайде.
Добавьте 50 микролитров 4% параформальдегида к 1,25 микролитрам PBS, чтобы сделать фиксаторный раствор, затем поместите три рассеченных сердца в один гидрофобный барьерный круг и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Декантирует раствор под микроскопом и сушит образцы при комнатной температуре в течение не менее пяти минут. Мойте слайды три раза в ПБСТ в течение пяти минут за одну стирку.
Добавьте 50 микролитров BSA к 1000 микролитрам PBST для получения 5%-ного раствора BSA и инкубируйте слайды во влажной камере в течение одного часа, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение пяти минут за одну стирку. Развести два микролитра мышиного моноклонального антитела против 8-гидроксидезоксигуанозина и два микролитра кроличьего поликлонального антитела против гамма-H2AX в 296 микролитрах PBST для получения рабочего первичного раствора коктейля антител.
Инкубируют образцы сердца с 50 микролитрами раствора коктейля первичного антитела в увлажненной камере в течение не менее одного часа при комнатной температуре или на ночь при четырех градусах Цельсия. Декантирует раствор и промывает образцы PBST три раза в течение пяти минут за одну стирку. Разбавьте один микролитр меченого FITC вторичного антитела против мыши против козы и один микролитр вторичного антитела против кролика psy-3 в 500 микролитрах PBST для получения рабочего раствора коктейля вторичных антител.
Инкубируют образцы с вторичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре в темноте. Декантирует раствор и промывает образцы PBS три раза в течение пяти минут за одну стирку. Добавьте 20 микролитров DAPI в образцы для ядерного окрашивания и инкубировать их в течение 30 минут при комнатной температуре.
Нанесите на горку крышку и запечатайте ее лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание и движение. Визуйте образцы под флуоресцентным микроскопом и количественно оцените флуоресцентный сигнал области сердца с помощью программного обеспечения ImageJ. Рассчитайте относительные изменения, используя среднее значение контрольных выборок DMSO и определите статистическую значимость данных.
Эмбрионы, подвергшиеся воздействию PM 2,5 в отсутствие или присутствие антиоксиданта, N-ацетил-L-цистеина, или NAC, оценивали на наличие пороков сердца. EOM от PM 2.5 стоил значительного увеличения сердечного тератогенеза, такого как отек перикарда, измененная петля и уменьшенный размер, по сравнению с сердцами, обработанными DMSO-контролем. Частота сердечных сокращений также была значительно снижена у эмбрионов, подвергшихся воздействию ЭОМ.
Добавление NAC ослабленных EOM-индуцированных пороков сердца. Иммунофлуоресцентный анализ был использован для оценки степени повреждения ДНК в тканях, обработанных EOM. Уровни экспрессии 8-гидроксидезоксигуанозина и гамма-H2AX были значительно увеличены в сердцах эмбрионов рыбок данио, получавших EOM, что указывает на увеличение окислительного повреждения ДНК и разрывов двух цепей ДНК соответственно.
Повреждение ДНК, вызванное ЭОМ, было частично противодействовано добавками NAC. При попытке этого протокола соблюдайте осторожность при мытье образцов PBS, потому что сердце рыбки данио может отслаиваться от слайда.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе используется метод иммунофлуоресцентного анализа для обнаружения повреждений ДНК, индуцированных PM 2.5, в препарированных сердцах эмбрионов zebrafish. Этот метод позволяет точно определить экспрессию целевого белка в сердце zebrafish.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Токсикология
Теоретические основы
- Иммунофлуоресценция представляет собой мощный метод визуализации экспрессии белков.
- Эмбрионы данио-рерио являются ценной моделью для изучения процессов развития.
- Известно, что воздействие PM 2.5 вызывает различные проблемы со здоровьем, включая повреждение ДНК.
- Понимание влияния экологических токсинов на развитие имеет решающее значение для общественного здравоохранения.
Цель исследования
- Оценить влияние PM 2.5 на целостность ДНК в сердцах zebrafish.
- Использовать иммунофлуоресценцию для выявления изменений в экспрессии белков.
- Разработать надежный метод оценки пороков развития сердца у эмбрионов zebrafish.
Используемые методы
- Сбор и обработка эмбрионов zebrafish.
- Иммунофлуоресцентный анализ для детектирования целевых белков.
- Наблюдение за эмбрионами под стереомикроскопом через 72 часа после оплодотворения.
- Статистический анализ с использованием однофакторного ANOVA и теста Тьюки для множественных сравнений.
Основные результаты
- Выявление повреждений ДНК в сердцах Danio rerio вследствие воздействия PM 2.5.
- Идентификация пороков развития сердца, таких как перикардиальный отек и нарушение петлеобразного изгиба.
- Количественная оценка частоты возникновения пороков развития в различных опытных группах.
- Подтверждение статистической значимости полученных результатов посредством анализа.
Выводы
- Воздействие PM 2.5 приводит к значительным повреждениям ДНК в сердцах zebrafish.
- Метод иммунофлуоресцентного анализа эффективен для изучения изменений в экспрессии белков.
- Данная модель может быть использована для дальнейших исследований экологических токсинов и биологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Данный протокол иммунофлуоресценции позволяет снизить риски, связанные с воздействием экологических токсикантов, путем количественной оценки биомаркеров повреждения ДНК в сердцах эмбрионов zebrafish, которые представляют собой прогностическую модель кардиотоксичности при развитии. Анализ поддерживает рабочие процессы валидации мишеней и фенотипического скрининга, связывая воздействие PM2.5 с окислительным стрессом и путями разрывов двухцепочечной ДНК. Он предоставляет трансляционные данные о биомаркерах для оценки рисков на ранних этапах поиска, помогая в сортировке химических библиотек в рамках портфеля исследований.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы путем обнаружения 8-OHdG и γH2AX в качестве механистических показателей окислительного повреждения ДНК и двухцепочечных разрывов.
- Операционная ценность: способствует биологической минимизации рисков за счет количественных показателей иммунофлуоресценции, которые проясняют активацию сигнальных путей в тканях сердца.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени путем корреляции изменений биомаркеров, вызванных PM2.5, с фенотипами пороков развития сердца.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированной ткани сердца zebrafish для последующего скрининга генотоксичных соединений с использованием метода детекции экспрессии белков на основе иммунофлуоресценции.
- Практическая ценность: Обеспечение стандартизированных, воспроизводимых количественных данных посредством анализа флуоресцентных сигналов в препарированных сердцах с помощью ImageJ.
- Ценность масштабируемости: Возможность повторного использования платформы для оценки изменений экспрессии белков, вызванных воздействием химических веществ из окружающей среды, в системе, релевантной для изучения заболеваний.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: демонстрирует релевантность заболеванию путем обнаружения повреждений ДНК в сердцах эмбрионов zebrafish — модели с консервативными путями развития сердечно-сосудистой системы.
- Практическая ценность: обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинической валидации, предоставляя понимание механизмов кардиотоксичности, вызванной PM2.5.
- Оценка прогресса с учетом рисков: служит основой для принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки снижения повреждения ДНК при сопутствующем применении антиоксидантов (например, NAC).
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая механистические показатели, которые повышают прогностическую достоверность кампаний по скринингу на ранних стадиях.
- Открывающая биология: способствует проверке гипотез и уточнению путей передачи сигнала путем количественной оценки биомаркеров повреждения ДНК в ответ на воздействие токсикантов из окружающей среды.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа и получение количественных данных посредством стандартизированного иммунофлуоресцентного окрашивания и количественного определения флуоресценции в сердцах zebrafish с помощью ImageJ.
- Аналитика: позволяет получать статистические данные (например, относительные изменения флуоресценции, значимость, определенную с помощью ANOVA), что делает возможным сравнение различных условий и валидацию результатов.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклиническими исследованиями за счет использования модели zebrafish с путями развития, значимыми для оценки кардиотоксичности у человека.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного использования метода для скрининга различных химических библиотек на генотоксический потенциал в модели сердца позвоночных.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую достоверность за счет механистического снижения рисков в анализе путей повреждения ДНК при скрининге тератогенности.
- Операционная ценность: гарантирует стандартизацию и воспроизводимость благодаря фиксированным протоколам диссекции, окрашивания и визуализации с использованием гидрофобных барьеров и флуоресцентной микроскопии.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) путем установления связи между изменениями биомаркеров и фенотипическими исходами, что снижает биологические риски на поздних стадиях токсикологических программ.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию соединений с поправкой на риск на основе потенциала повреждения ДНК в модели развивающегося сердца.
Особенности реализации
- Требуются навыки работы с эмбрионами zebrafish, проведения диссекции сердца и методов иммунофлуоресценции.
- Метод опирается на использование флуоресцентной микроскопии и программного обеспечения ImageJ для количественной оценки сигнала и статистического анализа.
- Необходима межкомандная стандартизация времени проведения диссекции, инкубации антител и процедур промывки во избежание потери тканей.
- При распространении анализа на другие ткани zebrafish или модели заболеваний следует учитывать необходимость адаптации метода.
- Существуют практические ограничения, такие как отрыв тканей сердца во время промывки, что требует осторожного использования PBS, как указано в исходных материалах.
