Сборка и эксплуатация акустофлюидного устройства для улучшенной доставки молекулярных соединений к клеткам

Этот протокол описывает сборку и работу акустофлюидной системы, которая может эффективно доставлять биомолекулы для различных исследований и клеточных терапевтических применений. Основным преимуществом данной системы является то, что она позволяет быстро доставлять биомолекулы к клеткам при сохранении их жизнеспособности. Это платформенная технология, которая позволяет трансформировать клетки для различных клеточных терапевтических применений, таких как лечение рака.

Начните с объединения 54 граммов основы PDMS и шести граммов отверждающего агента в чашке. Энергично и тщательно перемешайте шпателем в течение по меньшей мере одной минуты, затем положите чашку с раствором PDMS в адсорбатор примерно на 30 минут или до удаления остатков пузырьков воздуха. Поместите пластину с фоторезистической оболочкой с узорами, обращенными вверх, в 150-миллиметровую чашку Петри, затем вылейте раствор PDMS на форму.

При необходимости поместите чашку Петри внутрь адсорбатора и примените вакуум до тех пор, пока не исчезнут остаточные пузырьки воздуха. Переложите чашку Петри в лабораторную печь и выпекайте в течение двух часов при 60 градусах Цельсия, чтобы вылечить PDMS. После отверждения аккуратно извлеките PDMS из чашки Петри, разрезав по краям пластины лезвием бритвы.

Вырежьте каждое отдельное устройство с помощью ножа или лезвия бритвы, затем пробьете отверстия через впускные и выпускные отверстия, используя 2,5-миллиметровый биопсийный перфоратор. После обработки устройства PDMS кислородной плазмой немедленно поместите каждое устройство на чистый стеклянный микроскоп соды с каналами, обращенными к поверхности стекла. Позвольте устройствам склеиваться в течение ночи при комнатной температуре.

Аккуратно нанесите силикон на поверхность пьезоопротоанализа диаметром один сантиметр толщиной от одного до двух миллиметров, затем аккуратно выровняйте преобразователь с концентрической спиралью и аккуратно прижмите его к нижней части стекла микроскопа. Подключите микроконтроллер к компьютеру с помощью кабеля USB A-B. Должны загориться зеленые индикаторы питания.

Используйте соответствующее программное обеспечение на компьютере для загрузки программы, которая генерирует восьмимегерцовый сигнал. Припаять один дюйм провода 22 калибра к концу каждого провода на преобразователе PZT. Затем используйте его для подключения отрицательного клеммного провода датчика PZT к контакту GND.

Подключите положительный клеммный провод датчика PZT к выходному контакту через паяный провод. Вырежьте от трех до шести дюймов секций мягкой пластиковой трубки из tygon PVC и продвиньте трубку во впускные и выпускные отверстия. Может потребоваться вращать трубку, применяя давление, пока она не впишется в отверстие.

Опционально, клей может быть нанесен на соединение для склеивания PDMS и трубки вместе. Опционально установите акустофлюидное устройство и микроконтроллер в 3D-печатном корпусе. Соберите микрофлюидный резервуар в соответствии с инструкциями производителя.

Вырежьте от трех до шести дюймов секции 1/16 дюйма внутреннего диаметра tygon PVC мягкой пластиковой трубки и нажмите ее на трубу внутреннего диаметра 1/32 дюйма от микрофлюидного резервуара. При желании оберните соединение парафиновой пленкой, чтобы предотвратить утечку. Наполните 60-миллилитровый шприц окружающим воздухом со стороны микрофлюидного резервуара.

Установите шприцевой насос на скорость 200 миллилитров в час, чтобы протолкнуть растворы контрастных веществ через акустофлюидное устройство с объемным расходом 50 миллилитров в час и собрать образцы с выхода устройства в 50-миллилитровую центрифужную трубку. Приготовьте раствор фофилипидов в сцинтилляционном флаконе на 20 миллилитров, добавив 25 миллиграммов DSPC, 11,6 миллиграмма DSEPC, 0,26 миллиграмма DSPG и 0,88 миллиграмма стеарата полиоксиэтилен40. Добавляйте хлороформ до тех пор, пока все фосфолипиды не растворятся.

Выпарить хлороформ в осушителе в течение 48 часов с образованием сухой липидной пленки. Регидратируйте пену 10 миллилитрами стерильного PBS, затем обжаривают раствор липидов ультразвуком в течение трех минут с амплитудой 40% с образованием катионного мицеллярного раствора. После ультразвуковой очистки раствор фофилипидов можно хранить при двух-шести градусах Цельсия до одного месяца.

Для приготовления ультразвуковых контрастных веществ добавьте 200 микролитров катионного мицеллярного раствора в 600 микролитрах стерильного PBS в двухмиллилитровую стеклянную перегородку. Запечатайте флакон, обжав колпачок. Используйте 1,5-дюймовую иглу 20-го калибра, чтобы заполнить пространство головки флакона газом декафторбутаном в течение 30 секунд.

Амальгамируйте флакон с образованием перфторбутановых газонаполненных ультразвуковых контрастных веществ. Добавьте 25 микролитров ультразвукового контрастного вещества на один миллилитр клеточного раствора. Затем немедленно перекачиваем комбинированное контрастное вещество и клеточную смесь через акустофлюидное устройство.

Этот протокол создает акустофлюидную систему, которая может быть использована для усиления внутриклеточной молекулярной доставки в нескольких клеточных линиях. Внутриклеточная доставка флуоресцентного соединения, флуоресцеина, к первичным Т-клеткам человека была улучшена с помощью акустофлюидного лечения по сравнению с необработанной контрольной группой. Интенсивность флуоресценции Т-клеток увеличилась в пять раз после лечения, что указывает на усиленную доставку флуоресцеина.

Жизнеспособность клеток немного снизилась после акустофлюидного лечения, но оставалась выше 80%Акустофлюидное лечение усиливало внутриклеточную доставку консервантного соединения трегалозы к клеткам карциномы легкого A549 человека по сравнению с потоком в одиночку и клетками в необработанной контрольной группе. Добавление катионных микропузырьков в клеточный раствор имеет решающее значение. Внутриклеточная доставка биомолекул будет ограничена без катионных микропузырьков в растворе.

Эта платформа обеспечивает внутриклеточную доставку различных биомолекул, которые могут изменять клеточную функцию в исследовательских или терапевтических целях. После завершения этой процедуры может быть выполнена дополнительная клеточная характеристика для оценки воздействия доставки различных биомолекул.