Изоляция и визуализация живых, интактных кардиостимуляторных областей почечной лоханки мыши путем вибратомного сечения

Этот протокол дает неповрежденные области кардиостимулятора почечной лоханки, гладкомышеского органа в почке, который перекачивает мочу в мочеточник и в мочевой пузырь. В отличие от изоляции клеток из почечной лоханки, этот подход обеспечивает интактные среды in situ областей кардиостимулятора почечной лоханки и более физиологичную подготовку для изучения кардиостимуляции почечной лоханки. Человек, который никогда не выполнял эту технику, может изо всех сил пытаться разрезать однородные участки.

Первый пользователь должен убедиться, что почка находится на уровне вибратома и не ускоряет процесс резки. Используя внутренние тканевые щипцы и внутренние расслоители ножницы, защемляйте кишечник и поднимайте его подальше от брюшной стенки. Одновременно разрезайте нижнюю часть кишечника, свободную от тела в проксимальной части двенадцатиперстной кишки и дистальной части толстой кишки, чтобы получить доступ к забрюшину, содержащему почки.

Аккуратно защемить и приподнять дистальный конец мочеточник тканевыми щипцами. Используя ножницы для рассечения, разрезайте под защемленным мочеточником по направлению к почке, пока он не освободится от окружающей соединительной ткани. Как только почки будут подвергнуты воздействию, извлеките их по отдельности.

Наполните блюдо с силиконовым эластомером ледяным холодным раствором KRB. Перенесите почку в тарелку для рассечения и убедитесь, что она полностью погружена. Используйте тонкие пружинные ножницы и внутренние щипцы для удаления жировой ткани из основания почки, чтобы обнажить дистальную почечную лоханку, или RP, и проксимальный мочеточник.

Удалите проксимальный мочеточник и часть дистального отдела РП с основания с помощью тонких пружинных ножниц и щипцов. Проткните наружную почечную капсулу тонкими щипцами, отводя кончики от тела почек. Используя щипцы каждой рукой, защемляйте свободные концы капсулы и очищайте их до тех пор, пока оставшаяся почечная мембрана капсулы не будет полностью удалена.

Вставьте лезвие бритвы в держатель лезвия инструмента вибратома и отрегулируйте угол зазора лезвия примерно до 18 градусов. Отрегулируйте параметры лезвия, как указано в текстовой рукописи, гарантируя, что толщина сечения почки не превышает 150 микрометров, что негативно повлияет на эксперименты по визуализации ионов кальция. Используйте тупые щипцы, чтобы аккуратно схватить и извлечь приготовленную почку из ледяного холодного раствора KRB.

Немедленно поместите почку на абсорбивную бумагу примерно на две-четыре секунды, чтобы удалить лишнюю внешнюю влагу. Аккуратно прокатите почку по абсорбирующей бумаге, чтобы убедиться, что все стороны паренхимы высохли, чтобы была оптимальная адгезия почки к стадии вибратома. Немедленно нанесите тонкий слой цианоакрилатного клея на основание пластины образца вибратома и используйте тупые щипцы, чтобы поместить мочеточник почек стороной вниз на область, покрытую клеем.

Осторожно надавите вниз на верхнюю часть почки плоским краем щипцов в течение примерно 10-20 секунд, чтобы высушить клей. Прочно закрепите пластину образца на дне буферного лотка и отрегулируйте уровень раствора KRB так, чтобы верхняя часть почки была полностью погружена. Для автоматического сечения вибратома выберите начальное и конечное положения цикла резки лезвия вибратома на 0,5-1 сантиметр от почки, чтобы гарантировать, что вся плоскость почек будет разделена.

Запустите автоматический процесс резки, убедившись, что лезвие контактирует с почкой. С помощью щипцов собирайте от почки участки, которые высвобождаются из почки и сразу же переносите их в отдельные колодцы. Продолжайте протокол секционирования и используйте световой микроскоп для идентификации областей PKJ в срезах почек, пока области PKJ не станут более очевидными.

Наполните силиконовую эластомерную форму ледяным холодным раствором KRB. Перенесите в блюдо отдельный ломтик почки. Вставьте булавки Minutien по периферии среза почки, чтобы закрепить участок к основанию тарелки для визуализации.

Поместите тарелку для визуализации на ступень вертикального вращающегося дискового конфокального микроскопа и немедленно начните перфузию раствором KRB. Используйте объектив с низким увеличением погружения в воду, чтобы найти срез почки. Центрируйте поле изображения на участках среза, где присутствует PKJ, используя ориентиры.

Как только PKJ будет найден, используйте объектив с погружением в воду с более высоким увеличением, чтобы увеличить интересуемую область. Различают различные клетки, представляющие интерес для различных типов переходных периодов ионов кальция в стенке PKJ. После того, как интересующие ячейки были идентифицированы, отрегулируйте интенсивность лазера, чтобы получить хорошее отношение сигнал/шум, и записывайте изображения с временной частотой дискретизации от 16 до 32 Гц.

Легкие микроскопические изображения целых участков почек показывают аннотированные ориентиры одной области PKJ. Множественные области PKJ присутствуют близко к внутреннему продолговатему мозгу и дистальной почке. Здесь показаны местоположения почечных артерий PKJ и границ PKJ.

Здесь показан участок PKJ от мыши, экспрессирующей GCaMP в альфа-положительных клетках PDGFR. Тонкую стенку PKJ, подвешенную между паренхималистной тканью, можно различить с помощью таких ориентиров, как почечная артериола. Экспрессия GCaMP6f в этой специфической трансгенной ткани распространяется по всей ширине PKJ как в мышечном, так и в адвентициальном слоях.

В PDGFR альфа GCaMP6f положительных почечных срезах сеть клеток, которая обычно простирается по ширине стенки PKJ, является флуоресцентной и отображает колеблющиеся переходные переходные ионы кальция различной продолжительности и частоты. В положительных почечных срезах SMC GCaMP3 в мышечном слое присутствует слой положительных клеток GCaMP3. Пространственно-височно-височно-повальная карта показывает, что альфа-положительные клетки PDGFR, расположенные в адвентиции PKJ, вызывают длительные низкочастотные переходные ионы кальция, тогда как SMC чаще запускают переходные ионы кальция меньшей продолжительности.

Аналогичным образом, также наблюдался массив флуоресцентных сигналов ионов кальция внутри и вокруг собирающих протоков и колебательных переходных процессов ионов кальция в SMC. При попытке этой процедуры важно, чтобы почка была как можно более ровной во время вибратомного сечения, чтобы обеспечить равномерное высвобождение срезов почек из блока. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как изоляция одиночных клеток, иммуногистохимия и молекулярные исследования, чтобы расширить наше понимание механизмов кардиостимулятора в почечной лоханке.