Запись электрических токов через плазматическую мембрану сперматозоидов млекопитающих

Запись электрической активности сперматозоидов с помощью техники патч-клампа сыграла ключевую роль в идентификации различных ионных каналов сперматозоидов и понимании электрофизиологии сперматозоидов на молекулярном уровне. Этот метод отлично измеряет электрофизиологические и фармакологические отпечатки ионных каналов и является самым надёжным инструментом для идентификации ионных каналов. Учитывая физиологическую важность ионных каналов и электрогенных транспортеров для мужской фертильности, эта техника является мощным инструментом для понимания определённых дефектов сперматозоидов, приводящих к бесплодию.

Для изготовления микропипеток начинайте с боросиликатных стеклянных капилляров с внешним диаметром 1,5 миллиметра, внутренним диаметром 0,86 миллиметра и внутренней нитью. Убедитесь, что внутренний диаметр наконечника пипетки составляет примерно два микрометра до полировки и уменьшается до 0,5 микрометра после правильной полировки. Соберите агаровый мост, чтобы поддерживать стабильность окружающей среды вокруг опорного электрода.

Сделайте стеклянный капилляр в форме буквы L, согнув его под небольшим огнём на горелке Бунзена и дайте остыть. Приготовьте раствор 1% агарозы в одном молярном хлориде калия и нагрейте его в микроволновке, пока агароза не растает и раствор не станет прозрачным. Аккуратно заполните L-образный стеклянный капилляр агарозой, чтобы избежать пузырьков воздуха, и дайте остыть до комнатной температуры.

Или же погрузить L-образный стеклянный капилляр в расплавленную агарозу. Покрутите контейнер несколько раз и снова нагрейте в микроволновке до кипения агарозы, что выведет пузырьки воздуха из агарного моста. Откройте нижнюю брюшную область мыши ножницами и извлеките оба эпидидимида.

Поместите их в 35-миллиметровую миску для клеточной культуры, наполненную раствором с высоким содержанием солёного раствора или HS, предварительно прогретой до комнатной температуры. Перенесите эпидидимиды в новую контейнер с раствором HS и тщательно удалите весь остаточный жир. Разделите эпидидимиды на капут, корпус и кауду с помощью лезвия скальпеля с номером 15.

Перенесите корпус каждого привидного привидения в новую контейнер с раствором HS. Сделайте несколько разрезов в изолированной части эпидидимиса с помощью лезвия скальпеля с остроконечным номером 11. Переместите части эпидидимидов с несколькими разрезами в микроцентрифугную трубку объемом 1,5 миллилитра с раствором HS.

Кратко встряхните сперматозоиды из эпидидимиса в раствор с помощью щипцов Superfine Dumont Type 5A. Затем отбросьте эпидидимиды и оставьте трубку при комнатной температуре на 10 минут. Подождите, пока твёрдое вещество осадится на дно трубки.

Затем перенесите супернатант в другую 1,5-миллилитровую микроцентрифугную трубку. Найдите подходящую сперматозоидную клетку с помощью цитоплазматической капли с увеличением в 600 раз. Убедитесь, что цитоплазматическая капля овальная и имеет слегка вытянутую веретенообразную форму.

Выберите подвижный сперматозоид с головкой, прикреплённой к капельному скользю, чтобы сперматозоид частично закрепился, но цитоплазматическая капля и остальная часть жгутика продолжают двигаться с жгутиками. Убедитесь, что головка сперматозоида свободно прикреплена к закрышке. После визуального отбора сперматозоида с правильной морфологией наполните микропипетку раствором пипетки и закрепите её в держателе пипетки.

Чтобы сохранить кончик пипетки чистым от мусора, приложите положительное давление на неё с помощью U-образной трубки. Опустите пипетку и погрузите её кончик в раствор для ванны. Чтобы чётко визуализировать клетку, разместите кончик пипетки над цитоплазматической каплей так, чтобы отверстие кончика было выровнено по диагонали к капле.

Быстро опустите кончик пипетки к капле, чтобы они оказались в одной фокальной плоскости. Как только кончик пипетки касается капли, приложите отрицательное давление на пипетку, чтобы переместить часть капли в кончик и создать гига-омовое уплотнение. Затем поднимите сперматозоид из обложки.

Компенсируйте временную переходность случайной ёмкости с помощью компенсаторного режима усилителя перед переходом в режим всей ячейки. Выполните обломку и переход в режим всей ячейки, применяя одну миллисекунду, постепенно увеличивающие импульсы напряжения в сочетании с очень лёгким всасыванием. После каждого импульса пробивного напряжения запустите мембранный тест, чтобы проверить, появляется ли более высокая емкость.

Подбирайте более крупную емкость для определения ёмкости всей ячейки, а также её сопротивления доступу. После успешного взлома приступайте к запланированным экспериментам с зажимом целой ячейки, например, применению различных растворов для ванны с разными соединениями или измерения активности каналов с помощью протоколов шага напряжения или повышения напряжения. Запись CatSper проводилась путём установления высокостойкого уплотнения между пластырной пипеткой и сперматозоидом млекопитающих у её цитоплазматической капли.

Плотности цельных клеток CatSper были зафиксированы на сперматозоидах каудальных нейронов дикого типа и каудальных нейронных сперматозоидов с дефицитом CatSper. Сперматозоиды разных видов разнообразны по морфологии и внутренним регуляторным путям. Сперматозоиды приматов и людей демонстрировали схожие свойства и регуляцию каналов CatSper.

Интересно, что активация CatSper прогестероном, по-видимому, уникальна для сперматозоидов приматов. Сперматозоиды кабанов, быков и грызунов не проявляли изменений токов CatSper, стимулируемых прогестероном. У сперматозоидов быков и кабана даже базальная активность каналов CatSper была ниже обнаруживаемых пределов, что говорит о том, что приток кальция и последующий гиперактивация обусловлены другими каналами или транспортёрами, либо что для активации их каналов требуется другой естественный стимулятор.

Маленькие, гладкие, однородные и не слишком опухшие цитоплазматические капли лучше всего подходят для патч-зажима. Избегайте использования этих крошечных односторонних, раздутых и полностью прозрачных цитоплазматических капель, так как они приведут к слабому или отсутствующему уплотнению. Эта техника позволяет детально изучать конкретные воздушные каналы в их естественной экспрессирующей системе, а успех зависит от высококачественных вариативных сперматозоидов, чистых областей, базовых интеллектуальных физиологических навыков, терпения и, что важнее всего, настойчивости.