Иммунофлуоресцентное окрашивание, конфокальная визуализация и 3D-реконструкция синоатриального и атриовентрикулярного узла у мыши
22 декабря 2020 г.
Мы предоставляем пошаговый протокол для иммунофлуоресцентного окрашивания синоатриального узла (SAN) и атриовентрикулярного узла (AVN) в сердцах мышей.
Этот протокол объясняет необходимые шаги для выполнения микродиссекции, иммунофлуоресцентного окрашивания и микроскопии специально для синусового узла и AV-узла у мыши. Методология цельного монтирования выгодна для решения точной 3D-локализации и морфологии синуса и AV-узла, а также для изучения взаимосвязи с окружающими тканями. Морфология тканей в значительной степени сохраняется с минимальным обезвоживанием и физическим разрывом тканей.
Для начала проколите сердце иглой 27 калибра в области верхушки, осторожно протолкнув иглу в левый желудочек и осторожно введя от пяти до 10 миллилитров ледяного PBS для обильного сердца. Осторожно поднимите сердце с помощью пинцета и разрежьте крупные сосуды, чтобы удалить сердце. Поместите сердце в диссекционную чашку, наполненную ледяным PBS, под микроскопом для препарирования.
После определения ориентации сердца переверните сердце так, чтобы передняя часть сердца оказалась на дне посуды. Обездвижите сердце, вставив маленькие булавки через верхушку и придаток предсердия в агарозу на дне чашки для вскрытия. С помощью тонкого пинцета и ножниц осторожно удалите несердечную ткань вокруг верхней и нижней полой вены.
Чтобы обнажить междустрочную область, удалите большую часть желудочков, разрезав параллельно борозде между желудочками и предсердиями с помощью микроножниц. Для фиксации и обезвоживания поместите образец в 4% параформальдегид на ночь при температуре четыре градуса Цельсия. На следующий день переведите сердце в 15%-ный раствор сахарозы и инкубируйте его в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия.
После инкубации переведите сердце в 30%-ный раствор сахарозы еще на 24 часа при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте сердце в 1% Тритоне Х-100, разведенном в PBS. Затем заблокируйте и пропитайте его в блокирующем растворе на ночь при четырех градусах Цельсия.
Поместите сердце в пробирку объемом 1,5 миллилитра и инкубируйте его с кроличьим антимышиным антителом Connexin 43 и крысиными антителами против мыши HTN4, разведенными блокирующим раствором, в течение семи дней при четырех градусах Цельсия. Через семь дней удалите раствор, содержащий первичные антитела, с помощью пипетки. Промойте сердце 1% раствором Triton X-100 три раза в течение одного часа за промывание на орбитальном шейкере.
Повторите этапы промывания после инкубации вторичными антителами и DAPI. Подготовив пластиковые кольца и наполнив их пластилином, поместите сердечко в пластилиновую канавку тыльной стороной сердца вверх. Определите САН, которая расположена на дорсальной стороне сердца с межкавальной областью.
Добавьте PBS в сердце, чтобы вытеснить весь воздух в полости до тех пор, пока сердце полностью не будет покрыто PBS. Нанесите силикон на края пластикового кольца. Аккуратно вдавите окружающую часть образца в пластилин для фиксации сердца и накройте сердце покровным листом.
Затем осторожно нажмите на тыльную сторону пластилина, чтобы выдавить часть PBS, и прикрепите сердце к защитному листу, стараясь избежать пузырьков воздуха в области визуализации. Поместите целые образцы окрашивания вверх ногами на платформу конфокального микроскопа и продолжайте визуализацию, как описано в текстовой рукописи. Параметры для каждого канала конфокального микроскопа задаются с помощью соответствующего программного обеспечения.
Этот протокол был использован для выполнения конфокальной микроскопии как синоатриального узла, так и атриовентрикулярного узла в сердцах мышей. Специфическое окрашивание проводящей системы и рабочего миокарда флуоресцентными антителами, нацеленными на HCN4 и Connexin 43 соответственно, позволяет идентифицировать синоатриальный узел и атриовентрикулярный узел в пределах интактной анатомии. Этот протокол окрашивания позволяет изучать взаимодействие различных типов клеток с использованием различных антител.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описаны этапы проведения иммунофлуоресцентного окрашивания цельных препаратов синоатриального (СА-узел) и атриовентрикулярного (АВ-узел) узлов сердец мышей. Данная методика позволяет точно определить 3D-локализацию и изучить морфологию этих сердечных структур.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Биология сердечно-сосудистой системы
- Методы иммунофлуоресценции
Теоретическая база
- Синоатриальный узел (САУ) и атриовентрикулярный узел (АВУ) имеют критическое значение для функционирования сердца.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание целых препаратов позволяет детально изучить морфологию этих узлов.
- Данный метод сохраняет морфологию тканей при минимальной дегидратации.
- Понимание взаимосвязи между этими узлами и окружающими тканями имеет принципиальное значение для кардиологических исследований.
Цель исследования
- Предоставить подробный протокол окрашивания синоатриального (SAN) и атриовентрикулярного (AVN) узлов в сердцах мышей.
- Способствовать изучению 3D-локализации сердечных узлов.
- Углубить понимание взаимодействий в тканях сердца.
Используемые методы
- Микродиссекция сердец мышей.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание целого препарата.
- Микроскопия для визуализации окрашенных тканей.
- Использование ледяного PBS для консервации тканей.
Основные результаты
- Успешное окрашивание SAN и AVN в сердцах мышей.
- Наблюдалось сохранение морфологии тканей.
- Достигнута четкая визуализация 3D-локализации.
- Углубление понимания взаимосвязей сердечных узлов с окружающими тканями.
Выводы
- Данный протокол эффективен для изучения SAN и AVN у мышей.
- Иммунофлуоресцентное окрашивание целых образцов является ценным методом в исследованиях сердца.
- Дальнейшие исследования могут основываться на этой методологии для получения более глубоких данных.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Трехмерная визуализация синоатриального и атриовентрикулярного узлов с высоким разрешением на моделях мышей устраняет критический пробел в исследованиях электрофизиологии сердца, обеспечивая точное анатомическое и клеточное картирование. Эта возможность повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней на ранних стадиях изучения механизмов аритмии и обеспечивает трансляционную преемственность от этапа открытия до доклинических кардиологических исследований. Сохранение целостности тканей и возможность мультиплексного анализа типов клеток делают данный рабочий процесс ценным многократно используемым инструментом для портфелей исследований и разработок в области сердечно-сосудистых заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить детальный анализ популяций клеток водителя ритма и проводящей системы in situ.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет выяснения взаимосвязи между структурой и функцией узлов.
- Облегчает достоверную идентификацию мишеней, имеющих значение для развития аритмогенеза.
- Обеспечивает анатомический контекст для функциональных исследований и проверки гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать цельные валидированные системы тканей сердца для последующих этапов визуализации и анализа.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты иммунофлуоресцентного анализа узловых и миокардиальных маркеров.
- Обеспечивает возможность мультиплексного мечения антителами для оценки нескольких типов клеток в одном образце.
- Способствует стандартизации и масштабируемости анализа для проведения сравнительных исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет трехмерные анатомические данные с релевантными доклиническими моделями нарушений проводимости сердца.
- Обеспечивает непрерывность процесса от молекулярного поиска до валидации на уровне тканей.
- Позволяет осуществлять продвижение потенциальных мишеней с учетом рисков на основе структурных и клеточных данных.
- Поддерживает разработку биомаркеров путем картирования взаимодействий между клетками узлов и немиоцитами.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный рабочий процесс иммунофлуоресцентного окрашивания целых образцов и конфокальной визуализации связывает этапы первичного поиска, валидации мишеней и доклинических исследований сердца, предоставляя высокоинформативные количественные анатомические данные.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей в исследованиях проводимости сердца.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные данные иммунофлуоресценции для идентификации узлов.
- Аналитика: Обеспечивает 3D-реконструкцию и сравнительный анализ областей узлов и миокарда.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает анатомическую и клеточную непрерывность для доклинических моделей аритмии.
- Корпоративное повторное использование: Создает стандартизированную платформу для визуализации и анализа для команд по исследованиям и разработкам в области сердечно-сосудистых заболеваний.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации кардиальных мишеней.
- Операционная ценность: стандартизирует подготовку тканей и визуализацию для получения воспроизводимых и масштабируемых результатов.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала в программах по поиску кардиальных мишеней.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритизацию мишеней и моделей проводящей системы сердца с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области диссекции сердца, иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии.
- Необходим доступ к современным платформам визуализации и программному обеспечению для анализа изображений.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов обработки тканей и использования антител.
- Может потребоваться адаптация для различных моделей сердца или видов животных.
- Размер образца и проникающая способность антител могут ограничивать пропускную способность при крупномасштабных исследованиях.
