Микроинъекция эмбриона и нокаут-мутантная идентификация CRISPR/Cas9 Генетически отредактированная Helicoverpa Armigera (Hübner)

Хлопковый червь является одним из самых разрушительных вредителей во всем мире. Редактирование генома с помощью технологии CRISPR/Cas9 позволяет продолжить исследование функции генов и взаимодействия между различными генами в этом организме. Двумя основными преимуществами данной методики является то, что она обладает высокой специфичностью и является передедливой.

Чтобы выбрать мишени sgRNA, перейдите на онлайн-сайт CRISPR для поиска возможных направляющих сайтов и экзонов, близких к пяти основным нетранслируемым областям гена. Введите последовательность экзонов в текстовое поле и выберите целевой геном Helicoverpa armigera. Выберите опцию PAM для 20 BPNGG и оставьте остальные настройки на параметрах по умолчанию, согласно руководствам пользователя веб-сайта.

Сравните прогнозируемые направляющие последовательности из программного обеспечения и выберите направляющую последовательность из 20 пар оснований, содержащих один или два гуанина вблизи пяти простых непереведенных областей с самой высокой прогнозируемой эффективностью и наименьшим количеством несоответствий для повышения эффективности редактирования и уменьшения нецелевого редактирования. Для подготовки эмбрионов отберите 50 здоровых особей из трехдневных самцов и двухдневных самок и смешайте их в чистой клетке сетки. Поместите в клетку кусочек влажного хлопка, содержащий 10% раствор сахара.

Накройте клетки сетки марлей и закрепите марлю резинкой. Распылите воду на марлю, чтобы она оставалась влажной. Нарежьте черную ткань на соответствующий размер и замените влажную марлю этой черной тканью, чтобы обеспечить свободное положение яйцеклеток в течение 30 минут.

Вставьте двустороннюю ленту на предметное стекло микроскопа. С помощью щипцов наклейте пластыри с яйцами в ряд на поверхность двусторонней ленты. Нажмите на край каждого пластыря, чтобы убедиться, что они прочно прилипают к ленте.

Соберите от 50 до 100 яиц на предметное стекло микроскопа. Перед микроинъекцией держите микроскоп на льду, чтобы задержать развитие эмбрионов. Подготовьте иглу, потянув за капиллярное стекло с помощью съемника микропипетки, как описано в текстовой рукописи.

Измельчите наконечник иглы с помощью микрошлифовальной машины до острого наконечника. Готовят инъекционные растворы, добавляя два микролитра коммерциализированного белка Cas9 и sgRNA в воду без RNace в ПЦР-трубке для получения 10-микролитровой объемной смеси. Хорошо перемешать путем пипетки и положить на лед.

Задайте параметры электронного микроинжектора. Загрузите два микролитра смеси в иглу с помощью наконечника пипетки микрозагрузчика, отсасывая как можно больше остаточного воздуха в кончике иглы. Подключите инъекционную иглу к микроманипулятору и обеспечьте плотное соединение между двумя частями.

Поместите слайд в чашку Петри и поставьте его на сцену микроскопа. Осторожно вставьте кончик иглы в верхнюю полусферу эмбриона под углом 45 градусов. Нажмите на педаль, чтобы доставить смесь в эмбрион, что приведет к небольшому расширению эмбриона.

Немедленно втяните иглу из эмбриона и перемещайте чашку Петри одной рукой, пока следующий эмбрион не окажется рядом с иглой. Введите не менее 300 эмбрионов, используя ту же процедуру, чтобы обеспечить достаточное количество вылупления. Накройте крышку чашки Петри после инъекции.

Когда цвет поверхности эмбрионов потемнеет, поместите искусственную диету в чашку Петри вокруг предметного стекла микроскопа. Подготовьте 24-луночные культуральные пластины и заполните каждую лунку до 1/3 ее объемной емкости искусственной диетой. Выделите вылупившихся личинок с помощью небольшой кисти и перенесите их на 24-луночную культуральную пластину, чтобы в одной скважине была одна личинка.

Когда личинки вырастут до третьей стадии звезды, переведите их на новую стеклянную пластичную этру. Переведите недавно заключенных самцов G-zero и взрослых самок дикого типа в свежую сетчатую клетку в равном соотношении. Снабдите их 10%-ным раствором сахара, опущенным в ватные шарики.

Выращивайте насекомых обычными методами до окукливания G-one. Используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить заднюю ногу и поместить каждую ногу в трубку Lysing Matrix. Гомогенизировать заднюю ногу с помощью тканевого гомогенизатора.

Извлеките геномную ДНК гомогенизированного образца с помощью коммерческого набора для экстракции гДНК в соответствии с инструкциями производителя. Амплифицируйте сегмент гена с помощью генотипирующих праймеров и условий реакции ПЦР из текстовой рукописи. Подтвердите генотип с помощью службы секвенирования генов.

Поместите особей G-one того же генотипа в одну сетчатую клетку, самостоятельно скрестите потомство G-one и продолжайте скрининг с использованием тех же методов. Целевой сайт интересующего гена находился в его втором экзоне. Этот участок был высоко сохранен, и фрагмент целевой полосы синтезированной сгРНК был подтвержден с помощью электрофореза агарозного геля.

Мутантное обнаружение одной мишени сгРНК выполнялось путем секвенирования продуктов ПЦР из родительских единиц G-one. Эффективность использования неперекрывающихся пар сгРНК в разных экзонах была продемонстрирована, поскольку большое удаление мутантов было легко отличить от сковород дикого типа. После получения определенного количества мутантных особей могут быть проведены электрофизиологические или поведенческие эксперименты для уточнения функции генов и взаимодействия между различными генами.