Функциональная оценка кишечной проницаемости и трансэпителиальной миграции нейтрофилов у мышей с использованием стандартизированной модели кишечной петли

Кишечная модель является широко адаптируемым и физиологическим способом измерения того, насколько протекает кишечник и как лейкоциты мигрируют в кишечнике у мышей in vivo. Этот метод помогает лучше понять механизмы, лежащие в основе повышенной кишечной проницаемости и патологического воспаления кишечника. Этот метод может быть использован, чтобы помочь в нашем понимании механизмов, лежащих в основе барьерной функции кишечника, и патологического воспаления, как видно при язвенном колите и болезни Крона.

Эта модель использует хорошо васкуляризованный, экстериоризованный сегмент кишечника, либо подвздошной кишки, либо проксимальной части толстой кишки, для изучения кишечной барьерной функции или набора иммунных клеток у мышей. Благодаря этому широкому применению модель кишечной петли может обеспечить понимание заболеваний, возникающих в результате протекания кишечного барьера, а также воспалительной реакции. Борьбу можно преодолеть, практикуя хирургические шаги.

Критически важно экстериоризировать полностью васкуляризованный сегмент кишечника и выбрать подходящие места для перевязок, чтобы избежать кровотечения. Модель кишечной петли является микрохирургической техникой, поэтому, как и в случае с другими хирургическими процедурами, она значительно выигрывает от визуальной демонстрации и пошагового представления метода. После достижения хирургической плоскости анестезии начните с очистки меха брюшной средней линии спиртовыми тампонами или марлевой губкой, пропитанной 70% этанолом.

Не смачивайте широкий участок меха спиртом для предотвращения переохлаждения. С помощью ножниц выполните лапаротомию средней линии. Сделайте горизонтальный разрез в середине живота, и обнажите брюшину, заботясь о том, чтобы не травмировать внутрибрюшные органы.

Поместите предварительно нарезанную мокрую ватную марлю на открытую внутрибрюшную полость. Используйте влажные ватные тампоны для мобилизации и экстериоризации слепой кишки и аккуратно поместите ее на мокрую ватную марлю. Затем мобилизуйте и мягко экстериоризуйте подвздошную кишки.

Разверните не менее шести сантиметров терминальной подвздошной кишки на влажной ватной марле, не нарушая брыжеечные сосуды и кровоснабжение. Держите открытые ткани влажными в любое время с теплым HBSS. Определите основную артерию, снабжающую подвздошную кишки в бледентерии, близко к слепой кишки.

Затем найдите два участка перевязки в жентерии, которые свободны от критических кровеносных сосудов. Крепко захватите терминальную подвздошную кишки тупыми тканевыми щипцами и используйте тонкие щипцы для фенестрации мезентерии, избегая кровеносных сосудов. Наложите шелковый шов на перфорацию и завяжите хирургический узел, чтобы создать первую перевязку.

Используйте линейку, чтобы измерить четыре сантиметра от первой лигатуры и создать вторую лигатуру. Аккуратно разрезайте рядом с каждой перевязкой тонкими ножницами, чтобы изолировать четырехсантиметровую петлю подвздошной кисти, сохраняя кровоснабжение и брыжеечную мембрану нетронутыми. Осторожно промойте содержимое сегмента петли подвздошной кисти теплым HBSS с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу размером 10 миллилитров.

Обязательно вымывайте просветное содержимое из брюшной полости, чтобы сохранить место операции чистым. Обрежьте два разрезанных конца промытой подвздошной петли шелковым швом. Используйте один миллилитр шприца с иглой 30 калибра, чтобы медленно вводить 250 микролитров реагента, такого как FITC-декстранс или хемоцин, в просвет кишечника.

Петля подвздошной кисти будет надуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой. Закройте брюшную стенку с помощью игольчатого держателя, анатомических щипцов и 3,0 нерассасывающихся шелковых швов обратной режущей иглой. После высыхания животного для предотвращения переохлаждения поместите его в регулируемую температуру анестезионную камеру на инкубационный период.

Подготовьте мышь к операции и экстериоризуйте мекулу, как было показано ранее. Используя влажные ватные тампоны, экстериоризируйте всю подвздошную кишечель и поместите ее поверх влажной ватной марли. Выявляют проксимальный комплекс толстой кишки и кровоснабжение, расположенное в мезоколоне.

Мобилизуйте проксимальную обивку и создайте первую лигатуру в области, свободной от сосудов в мезоколоне на уровне около 0,5 сантиметра от слепой кишки. Измерьте два сантиметра от первой лигатуры и создайте вторую лигатуру в области, свободной от кровоснабжения в мезоколоне. Используя тонкие ножницы, аккуратно разрезайте рядом с каждой перевязкой, чтобы выделить двухсантиметровый pcLoop.

Осторожно промойте pcLoop теплым HBSS для удаления фекалий с помощью гибкой желтой питательной трубки, прикрепленной к шприцу 10 миллилитров. Обязательно вымывайте просветное содержимое из брюшной полости, чтобы сохранить место операции чистым. Затем обрезайте два разрезанных конца промытого pcLoop с помощью шелкового шва.

Используйте один миллилитр шприца с иглой 30 калибра, чтобы медленно вводить 200 микролитров реагента, такого как FITC-декстран или хемоцин, в просвет кишечника. PcLoop будет раздуваться, вызывая умеренное растяжение слизистой. Используйте влажные ватные тампоны, чтобы аккуратно положить обратно лигированный pcLoop, подвздошную кисть и тесную кисть.

Закройте брюшную стенку с помощью игольчатого держателя, анатомических щипцов и 3,0 нерассасывающихся шелковых швов обратной режущей иглой. После инкубационного периода усыплите обезболенную мышь и соберите ткани для анализа. С целью проверки точности модели I петли для оценки кишечной проницаемости был проведен анализ FITC-декстран pcLoop для оценки роли плотного соединения ассоциированного белка Jam-a в регуляции кишечной барьерной функции in vivo.

С моделью pcLoop 2,5-кратное увеличение уровня FITC-декстрана в сыворотке крови было количественно определено у мышей Jam-a по сравнению с контрольной частью. Аналогичные результаты были получены на мышах, у кого была селективная потеря Jam-a на эпителиальных клетках кишечника. Модель pcLoop использовалась для изучения полиморфноядерных нейтрофилов, или PMN, рекрутации в слизистую оболочку кишечника и последующей трансэпителиальной миграции in vivo.

Количество PMN в просветном содержании pcLoop количественно оценивали с помощью анализа проточной цитометрии. Количество ПМН, присутствующих в сегменте проксимальной кишки, было низким в физиологических условиях. Предварительная обработка провоспалительными цитокинами, TNF альфа и IFN гамма, до операции, привела к увеличению количества PMN, набранного в просвет pcLoop.

Введение химиоаттрактантата PMN LTB4 привело к резкому увеличению количества PMN. Иммуногистохимическое окрашивание ПМН в слизистой оболочке толстой кишки подтверждает повышенный набор ПМН после стимуляции цитокинами и LTB4. Вклад Jam-a в трансэпителиальную миграцию PMN был изучен с использованием модели pcLoop на мышах, имеющих селективную потерю Jam-a на эпителиальных клетках кишечника.

Потеря эпителиального Jam-a привела к снижению количества трансмигрированных ПМН в просвете толстой кишки по сравнению с контрольной частью помета. Критическим аспектом для этой техники является не забывайте сохранять кровоснабжение экстериоризированного сегмента кишечника при выполнении операции. Следуя этому протоколу, другие методы, такие как анализ кишечной проницаемости и анализ миграции нейтрофильных трансэпителиальных веществ, могут быть выполнены для исследования потери целостности барьера и воспаления кишечника in vivo.