Окрашивание, визуализация и анализ грибковых, циркумваллятных и нёбных вкусовых рецепторов
11 февраля 2021 г.
В данной работе описываются методы подготовки тканей, окрашивания и анализа целых грибовидных, циркумваллятных и небных вкусовых рецепторов, которые последовательно дают целые и неповрежденные вкусовые рецепторы (включая нервные волокна, которые их иннервируют) и поддерживают отношения между структурами в вкусовых рецепторах и окружающим сосочком.
Этот рабочий процесс вскрытия и анализа обеспечивает новый подход к анализу полной морфологии отдельных желудочков вкусовых нервов, преобразования чисел типа клеток и физических отношений между клетками. Сбор всего лингвального эпителия позволяет измерить абсолютное количество клеток и объем иннервации внутри всего вкусового рецептора. Этот подход более точен, чем оценки структуры клеток, основанные на выборке из секций, что снижает техническую изменчивость.
Это также первый метод, обеспечивающий детальный анализ клеток вкусовых рецепторов по отношению к их иннервации. Этот метод может улучшить исследования потенциальной схемы во вкусовой рецепторе, а также болезненных процессов и химиотерапии, которые нарушают нормальную вкусовую функцию. В большинстве этих случаев неясно, какая структура или связь нарушены, поэтому сохранение всех этих факторов нетронутыми позволяет проводить все анализы в рамках одной подготовки.
Наиболее распространенной ошибкой является попытка избежать повреждения эпителия, не рассекая достаточно близко к нижней стороне эпителия. Крайне важно удалить как можно больше подлежащей ткани, прежде чем замораживать ткань в тканевой плесени. Также важно убедиться, что эпителий лежит ровно в нижней части тканевой плесени.
Начните с размораживания и промывания языка в 0,1 молярном фосфатном буфере. Затем поместите 1/2 переднего языка, содержащего грибовидные сосочки, на стеклянную горку под рассекающим микроскопом. Используйте тупые щипцы и ножницы для рассечения, чтобы удалить мышцу и держать ткань открытой, когда лингвальный эпителий изогнут, обеспечивая плоскую ориентацию ткани, сохраняя лопасти грубых ножниц для рассечения параллельно эпителию.
Отбросьте вентральный неорогатый эпителий языка, так как он не содержит вкусовых рецепторов. Затем используйте тонкие ножницы для рассечения для более близкого рассечения к нижней стороне ороговевшего эпителия. Используйте тупые щипцы, чтобы положить кусок эпителия в тканевую форму и убедиться, что он лежит ровно.
Затем добавьте каплю оптимальной температуры резки, или OCT, в ткань. Поместите тканевую форму на ранее охлажденную металлическую основу под рассекающим прицелом, затем продолжайте слегка постукивать по ткани щипцами, пока ОКТ не замерзнет, гарантируя, что ткань замерзнет как можно более плоской. Как только OCT замерзнет, быстро добавьте дополнительный OCT и поместите форму в стакан с охлажденным 2-метилбутаном до замораживания.
Установите форму OCT на криостат и разрежьте ее на 20-микронные секции. Соберите каждый участок и просмотрите его под световым микроскопом, чтобы оценить его близость к основанию эпителия. После того, как ткань выбрита с нижней стороны эпителия, разморозьте эпителий и дважды промойте его в 0,1 молярного ПБ на шейкере.
Отрежьте твердое небо спереди к соединению мягкого и твердого неба, затем отделите мягкое небо от подлежащей ткани, убедившись, что все оставшиеся фрагменты кости отрезаны и удалив дополнительную мышечную и соединительную ткань. Удерживайте небо тупыми щипцами и удалите оставшиеся железы и потеряйте соединительную ткань, аккуратно соскребая их лезвием бритвы. Целые вкусовые рецепторы и вся иннервация вкусовых рецепторов у мышей Phox2b-Cre TdTomato были помечены окрашиванием язычного эпителия антителами к DsRed и кератиновой восьмерке.
Объем вкусовых рецепторов был измерен и не выявил корреляций между объемами вкусовых рецепторов и объемами иннервации ни в грибовидной, ни в циркумвалляционной областях измерения. Введение низкой дозы тамоксифена мышам TrkB CreER TdTomato вызывает рекомбинацию генов и маркировку небольшого количества нейронов. Здесь показан цельный вкусовой рецептор, окрашенный маркерами карбоангидразы четырехугольной ангидразы и фосфолипазы С бета два.
Этот вкусовой рецептор имеет две маркированные концевые беседки, которые показаны с удалением вкусового рецептора после реконструкции волокон. Использование программного обеспечения для визуализации на основе клеточных пикселей для определения ближайшей близости между нервными волокнами и клетками, передающими вкус, показало, что из 19 клеток, преобразующих вкус, синяя терминальная беседка находилась в пределах 200 нанометров от светло-голубой карбоангидразы четыре плюс клетка. Терминальная беседка, связанная с зеленой трассировкой, показана в пурпурном цвете и находится в пределах 200 нанометров как от светлой, так и от темно-синей карбоангидразы четырех с лишним клеток.
Окрашивание цельноусатых кератиновых восьми и 5-этинил-2'дезоксиуридин или EdU грибовидных вкусовых рецепторов показало, что меченые EdU клетки присутствовали как внутри, так и снаружи вкусовых рецепторов. Пурпурные и фиолетовые ядра наблюдаются вне кератиновых восьми плюс граница вкусовой рецепторки. Желтые, чирковые и синие клетки находились внутри вкусовой рецептора.
При попытке этого протокола этапы рассечения и замораживания тканей имеют решающее значение. Эти методы рассечения тканей могут сопровождаться окрашиванием различных клеток и структур для анализа отношений как внутри вкусовой рецептора, так и вне вкусовой точки, но и внутри сосочки. Это первый анализ целых вкусовых беседок в пределах вкусовой рецептора, а также их взаимосвязи со вкусопередающими клетками.
Сохранение и окрашивание нескольких из этих элементов в одном препарате расширяет возможности для анализа и уточняет возможные измерения.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной работе представлен новый метод цельного препарирования и анализа вкусовых почек, в частности грибовидных, листовидных и нёбных рецепторов, с сохранением их структуры и иннервации. Этот метод позволяет точно измерять количество клеток и объем иннервации, что углубляет наше понимание архитектуры вкусовых почек и влияния заболеваний на функцию вкуса.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Системная биология
Обзор
- Анализ вкусовых почек в целом позволяет получить представление об их морфологии и функциональных связях.
- Существующие методики часто характеризуются высокой вариабельностью из-за особенностей отбора проб.
- Понимание функций вкуса имеет решающее значение для исследований, связанных с нарушениями вкусового восприятия.
- Данное исследование направлено на определение полной структуры вкусовых почек в соотношении с их иннервацией.
Цель исследования
- Разработать надежный метод выделения и анализа интактных вкусовых почек.
- Исследовать взаимосвязи между клетками вкусовых почек и иннервирующими их нервными волокнами.
- Осветить значение данного исследования для понимания нейронных цепей, участвующих в восприятии вкуса.
Используемые методы
- В данном исследовании используется метод диссекции вкусовых сосочков языка в целом объеме.
- Биологическая модель включает вкусовые сосочки мышей Phox2b-Cre TdTomato и TrkB CreER TdTomato.
- В данном исследовании мультиомиксные методы анализа не применялись.
- Критически важными этапами являются тщательная диссекция и правильное замораживание ткани.
- Затем образцы анализировали с помощью методов окрашивания для визуализации различных типов клеток.
Основные результаты
- Данный метод позволил успешно сохранить и окрасить вкусовые почки в целостности, выявив их клеточную архитектуру.
- Измерения не выявили корреляции между объемами вкусовых почек и объемами иннервации.
- Метод визуализации на основе анализа пикселей клеток продемонстрировал близость нервных волокон к вкусовым трансдуцирующим клеткам.
- Маркировка EdU выявила пролиферацию клеток как внутри, так и за пределами границ вкусовой почки.
Выводы
- В исследовании представлен инновационный протокол анализа вкусовых почек, который может быть полезен для будущих исследований.
- Хотя мультиомиксный анализ не проводился, полученные результаты расширяют наше понимание функционирования вкусовых почек.
- Данный метод позволяет детально изучить клеточные взаимодействия, что имеет большое значение для исследования нарушений вкуса.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Анализ вкусовых почек методом целого препарата позволяет точно количественно определить клеточные и иннервационные параметры, снижая техническую вариабельность, характерную для методов анализа срезов. Этот метод способствует снижению рисков при изучении механизмов в нейронауке и сенсорной биологии за счет сохранения пространственных связей между трансдуцирующими клетками и нервными волокнами. Он представляет собой воспроизводимую платформу для оценки хемосенсорной функции в моделях заболеваний и в исследованиях терапевтического вмешательства.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути трансдукции вкуса посредством абсолютного подсчета клеток и пространственного картирования нервных терминалей.
- Практическая ценность: снижает систематическую ошибку и вариативность за счет сохранения целостности архитектуры вкусовых почек для воспроизводимого анализа.
- Прогностическая ценность: повышает достоверность определения мишеней путем установления связи между молекулярными маркерами и функциональными паттернами иннервации in situ.
Скрининг и разработка методов анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные данные, такие как объем вкусовых почек, объем иннервации и количество трансдуцирующих клеток, для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: упрощает рабочие процессы высокоточной визуализации, совместимые с мультиплексным окрашиванием и автоматизированным анализом изображений.
- Готовность метода: представляет собой масштабируемую систему для скрининга соединений, влияющих на целостность вкусовых почек или нейронную связность.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: позволяет анализировать нарушения взаимосвязи между вкусовыми почками и нервами, вызванные заболеванием или терапией, с использованием генетически меченых моделей.
- Практическая ценность: обеспечивает возможность проведения лонгитюдных исследований за счет повторного окрашивания и визуализации целых препаратов одной и той же ткани.
- Трансляционная преемственность: связывает результаты фундаментальных открытий с доклинической валидацией за счет сохранения нативной архитектуры ткани.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы по открытию биологических механизмов, позволяя проверять гипотезы о механизмах вкусовых ощущений и нейронных связях.
- Открывающая биология: способствует уточнению путей передачи сигнала и функциональной валидации типов вкусовых трансдуцирующих клеток посредством анализа пространственной ко-локализации.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели, необходимые для скрининга соединений в хемосенсорных исследованиях.
- Аналитика: использует визуализацию на основе анализа пикселей клеток для измерения субклеточных расстояний между нервными волокнами и вкусовыми рецепторами, что позволяет проводить сравнения на основе данных.
- Трансляционные исследования: сохраняет структурную целостность для изучения дисфункции вкуса в моделях химиотерапии, старения или генетических нарушений.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный протокол подготовки тканей, применимый для различных отделов вкусовой системы и моделей мышей.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования за счет устранения артефактов отбора проб и обеспечения возможности прямого наблюдения за взаимодействиями между клетками и нервами.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость благодаря стандартизированным процедурам диссекции, замораживания и окрашивания.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки сенсорных препаратов, обеспечивая понимание механизмов связывания с мишенью.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию соединений с учетом рисков на основе их воздействия на структуру и иннервацию вкусовых почек.
Особенности реализации
- Требуется опыт в микрохирургической диссекции и работе с тканями для сохранения целостности эпителия.
- Зависит от наличия криостата и системы заливки в OCT для правильной ориентации и заморозки тканей.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения единообразия протоколов монтажа и окрашивания тканей.
- Необходимо учитывать вариабельность плотности и размера вкусовых почек в грибовидных, околоперчегочечных и нёбных областях.
- Ограничено необходимостью использования специализированных инструментов визуализации и анализа для реконструкции нервных окончаний и количественного определения субклеточной близости.
