Пластинчатый анализ для измерения эндогенного высвобождения моноаминов в острых срезах мозга

Этот метод вводит простую технику обнаружения эндогенного высвобождения моноаминов с использованием острых срезов мозга. Установка использует 48-луночную пластину, содержащую держатель ткани для высвобождения моноамина. Высвобождаемый моноамин анализируется методом ВЭЖХ в сочетании с электрохимическим обнаружением. Кроме того, этот метод обеспечивает метод скрининга для обнаружения лекарств.

Этот метод представляет собой адаптацию широко используемых методов для изучения высвобождения моноаминов, позволяющих измерять эндогенное высвобождение, а не предварительно загруженные радиомаркированные моноамины в нескольких фармакологических условиях одновременно. Основные преимущества этой методики заключаются в том, что она достаточно экономически эффективна, можно исследовать сразу несколько фармакологических состояний, и мы можем изучать эндогенное высвобождение моноаминов со способностью различать везикулярное и транспортное опосредованное высвобождение. Чтобы приготовить срезы мозга от взрослых самцов крыс весом от 250 до 350 граммов после сбора урожая, сразу же поместили в мозг и ледяной холод насыщен кислородом рассеченный буфер и приобрели 300 микронных корональных участков мозга из каждой интересующей области.

Для дальнейшего рассечения срезов мозга осторожно переместите ткани на стеклянные слайды и используйте атлас мозга крысы, чтобы идентифицировать дорсальный стриатум на основе его темной полосатой структуры и идентифицировать гиппокамп на основе его близости к коре и его уникальной спиральной структуре. Разделите правое и левое полушария для их использования в качестве контрольных и экспериментальных срезов. Дорсальное полосатое тело может быть дополнительно рассечено на два миллиметровых удара.

Затем используйте пластиковую передаточную пипетку с модифицированным наконечником для переноса образцов в небольшие контейнеры, погруженные в насыщенный кислородом ледяной буфер рассечения с пузырьками кислорода. Чтобы индуцировать высвобождение моноамина, перенесите образцы тканей в каждую скважину изготовленной на заказ камеры оттока из 48 скважин, содержащей от 0,5 до одного миллилитра буфера эффлюкса на скважину с постоянным мягким бурлением, и позвольте образцам восстанавливаться в течение 30-50 минут при температуре 37 градусов Цельсия. В конце периода уравновешивания переместите тканевый держатель с мозговой тканью в скважины, содержащие 500 микролитров кислородного буфера эффлюкса с фармакологическим агентом или без него, постукивая держателем по краю скважины, чтобы предотвратить минимальный перенос буфера между лунками для 20-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.

В конце инкубации переместите держатель в новый набор лунок, содержащих 500 микролитров буфера эффлюкса с интересующим препаратом или без него и верните пластину в инкубатор клеточной культуры еще на 20 минут. Во время второй инкубации перенесите раствор из скважин из первой инкубации в микроцентрифужные трубки, содержащие 50 микролитров одной нормальной хлорной или фосфорной кислоты на льду, и маркируйте трубки номер один"В конце второй инкубации переместите держатель ткани в пустые колодцы с пластиной на льду и перенесите супернатанты из второй инкубации в новые микроцентрифужные трубки, содержащие 50 микролитров одной нормальной хлорной или фосфорной кислота на льду. Когда все супернатанты будут перенесены, добавьте один миллилитр буфера для расслоения ледяного холода в каждый колодец ткани и используйте небольшие пинцеты для переноса каждого образца ткани в новую микроцентрифужную трубку.

Извлеките буфер из пробирок и храните ткани при минус 80 градусах Цельсия, затем перенесите собранные инкубационные растворы в микроцентрифужные фильтрующие трубки для центрифугирования и поместите фильтрат на лед до анализа ВЭЖХ. Установите потенциал ECD и скорость потока в соответствии с рекомендацией производителя для обнаружения моноаминов. Нагрузка и соответствующая аликвота каждого образца, включая стандарты нейротрансмиттеров в ВЭЖХ для автоматической инъекции и обнаружения и позволяют прибору завершить анализ.

Затем используйте программное обеспечение для анализа ВЭЖХ для получения и анализа данных хроматографа с использованием стандартной кривой, состоящей из каждого моноамина, чтобы получить площадь под кривой на основе рекомендаций производителя. После шести часов функционального анализа образцы тканей остаются жизнеспособными, в то время как образцы, инкубированные с 1% Triton X-100, демонстрируют значительное снижение трансформации MTT. Острая 20-минутная обработка отделов гиппокампа и префронтальной коры головного мозга амфетамином вызывает значительное повышение внеклеточного уровня каждого моноамина.

Когда образцы предварительно обрабатывают флуоксетином, селективным ингибитором обратного захвата серотонина, вызванное амфетамином увеличение внеклеточного серотонина в гиппокампе и префронтальной коре не происходит, в то время как увеличение внеклеточной выработки дофамина и норадреналина не затрагивается. Кроме того, острая 20-минутная обработка дорсальных ударов стриатума амфетамином вызывает 35-кратное увеличение экспрессии внеклеточного уровня дофамина, в то время как лечение дорсальным полосатым стриатумом кокаином, блокатором моноаминового транспортера, приводит к значительному ингибированию внеклеточного дофамина, вызванного амфетамином. Увеличение концентрации внеклеточного хлорида калия для вызова деполяризации мембраны достаточно, чтобы индуцировать экзоцитотическое высвобождение моноаминов по сравнению с необработанными контрольными условиями, и ни флуоксетин, ни лечение кокаином не блокируют это глубокое поляризационное увеличение.

Крайне важно иметь чистые секции, точную локализацию ударов и поддерживать постоянную оксигенацию на протяжении всего эксперимента. Участки мозга могут быть использованы после экспериментов для дальнейшей биохимической обработки и анализа, таких как вестерн-блоттинг и гистология.