Визуализация и количественная оценка повреждения ДНК на основе эндонуклеазы

Это видео методологии знакомит с важнейшими этапами протоколов иммуноокрашивания и иммунопреципитации хроматина, регулярно используемых для изучения клеточного процесса, связанного с повреждением ДНК, а также для визуализации и количественной оценки набора белков, связанных с репарацией ДНК. Этот метод предоставляет исследователям мощные инструменты для идентификации новых белков, связанных с поврежденным геномным локусом, а также их постперекренческих модификаций, необходимых для тонкой настройки регуляции во время репарации ДНК. Поскольку эти методы могут быть применены для изучения различных клеточных процессов, они имеют потенциальную актуальность, если используются лазерные микрорадиационные или повреждающие системы индуцирования ДНК на основе ядра.

Недавно было разработано несколько мощных инструментов для индуцирования повреждения ДНК, специфичного для сайта, которое может быть использовано для расширения нашего понимания восстановления ДНК. Применяя биохимический и генетический подходы, эти предметы утвари необходимы для выявления клеточных событий, связанных с набором и сборкой комплексов репарации ДНК в месте повреждения ДНК. Более того, эти методы позволяют изучать эти процессы с разрешением одной клетки с использованием как фиксированных, так и живых клеток.

Поддерживать клетки U2OS в монослоях в питательной среде DMEM, дополненной 10% сывороткой для телят плода, 2 миллимолярными глутаминаминами и 1% антибиотически-антимикотическим раствором. Выращивайте клетки в увлажненной 5% среде углекислого газа при 37 градусах до достижения 80% слияния, обновляя среду каждые два-три дня. Аспирировать среду и промыть клетки PBS.

Отсоедините клетки раствором Трипсина-ЭДТА. Когда клетки отсоединяются, остановите активность трипсина, добавив к клеткам культуральная среда, в результате что клетка суспензии. Подсчитайте ячейки с помощью камеры подсчета ячеек.

Пластина 20 000 ячеек на миллилитр на скважину на 24-луночной пластине со стерильной 12-миллиметровой круглой крышкой скользит в каждой скважине. Инкубировать ячейки в течение 24 часов при 37 градусах в увлажненной 5% углекислотной среде, чтобы обеспечить прикрепление к крышке. Обработайте клетки 10 нанограммами на миллилитр неокарзиностатина или используйте соответствующий метод для индуцирования двухцепочечных разрывов с помощью систем на основе эндонуклеузы.

Инкубируйте клетки в течение одного-восьми часов при 37 градусах в увлажненной 5% среде углекислого газа, чтобы следить за кинетикой репарации ДНК. Зафиксируйте клетки 4%-формальдегидным раствором PBS в течение 20 минут при 25 градусах. Удалите фиксирующий раствор и промывайте ячейки PBS три раза в течение пяти минут каждая.

Удалите PBS и добавьте 0,2% Triton X, растворенного в PBS. Инкубировать образцы в течение 20 минут. Промыть ячейки три раза С помощью PBS.

Блокируют неспецифическое связывание с 5% BSA, разбавленным в BSA-PBST, и инкубируют образцы в течение не менее 20 минут. Добавьте необходимое количество первичного антитела, разведенного в 1%-ном растворе BSA-PBST. Поместите каждую крышку вверх ногами на парапленку или 10 микролитровую каплю разбавленного антитела.

Инкубируют образцы в камере влажности в течение полутора часов при четырех градусах. Поместите крышку обратно, будучи стороной вверх, в 24-скважинную пластину и трижды промывайте PBS. Добавьте надлежащее количество вторичного антитела, разведенного в 1% BSA-PBST.

Поместите каждую крышку вверх ногами на парапленку над 10-микролитровой каплей разбавленного антитела. Инкубируют образцы в камере влажности при четырех градусах в течение часа. Поместите крышку, устанавливаемую обратно, в 24-колодезную пластину и трижды помойте PBS.

Перед извлечением последнего моющих растворов PBS аккуратно выньте крышку ползубца и иглы, а затем положите их вверх ногами на стеклянные горки с капельками монтажной среды. Иммунопреципитация хроматина является широко используемым методом для идентификации паттернов связывания белков с ДНК. Чтобы выявить занятость белка репарации желаний вокруг DSB, специфическое антитело используется для иммунопреципитации интересуемого белка из препарата хроматина вместе с областью ДНК, с которой он связан.

Кроме того, ChIP обычно применяется для отображения наличия специфических постпереводных модификаций, используемых DSB в данном геномном локусе. Приблизительно 20 миллионов клеток на миллилитр следует культивировано в 15-сантиметровой чашке для каждого образца. Удалите питательную среду и дважды промыть клетки ледяным PBS.

Зафиксируйте клетки 1%-формальдегид-PBS раствором. Поместите пластину на орбитальный шейкер и осторожно перемешивайте в течение 20 минут. Прекратите фиксацию глицином, чтобы достичь конечной концентрации 125 миллимоляров и инкубируйте на орбитальном шейкере с мягким перемешиванием в течение пяти минут при 25 градусах.

Поместите тарелку на лед и дважды промойте ледяным PBS. Соскоблите ячейки в ледяном холодном PBS и переложите их в 15-миллилитровые конические трубки. Центрифугировать ячейки при 5 000 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах.

Осторожно аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в двухмиллилитровом буфере лизиса клеток и инкубировать на льду в течение 10 минут. Центрифуга при 5 000 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах. Осторожно выбросьте супернатант и повторно суспендировать гранулу в буфере ядерного лизиса от 500 до 1 500 микролитров и инкубировать на льду в течение 30-60 минут.

Переложите лисат в полистирольная коническая трубка, подходящая для ультразвуковой обшивки. Обработать лисатом ультразвуком, чтобы сбросить ДНК до среднего размера фрагмента от 300 до 1000 пар оснований. Подготовьте Dynabeads для предварительной очистки и иммунопреципитации.

Мойте бусины дважды в течение 10 минут при четырех градусах с буфером RIPA. Повторное суспендное увеличение dynabeads в том же объеме буфера RIPA, который вы взяли из исходного стокового решения на шагах 3.1. Предварительно очистите от 25 до 30 микрограмм хроматина каждого образца с четырьмя микролитрами Dynabeads путем вращения в течение одного-двух часов при четырех градусах.

Высадите динабусы магнитом и перенесите супернатант в новую трубку Эппендорфа. Добавьте соответствующее количество антител к каждому образцу хроматина и вращайте в течение ночи на четыре градуса. На следующий день добавьте 40 микролитров промытых динабус в каждый образец и высиживайте их в течение ночи, вращаясь на четыре градуса.

Промыть один раз 300 микролитрами с низким содержанием соли буфером в течение 10 минут с вращением на четыре градуса. Промыть один раз с 300-микролитровым солевым буфером в течение 10 минут с вращением на четыре градуса. Промыть один раз с буфером хлорида лития 300 микролитрами в течение 10 минут с вращением на четыре градуса.

Дважды промыть 300 микролитра TE в течение 10 минут с вращением для первой стирки на четыре градуса и второй стирки на 25 градусов. Добавьте 200 микролитровый буфер элюирования в бусины и высиживите их при 65 градусах в термошейкере в течение 15 минут с непрерывным встряхиванием. Перенесите супернатант в новую трубку и снова элюируют шарики в буфере элюирования 200 микролитров.

Добавьте 500 мкг на миллилитр протеиназы-К и полпроцента SDS и инкубируют образцы при 50 градусах в течение двух часов. Выполните экстракцию хлороформа и перенесите верхнюю водную фазу в новую трубку Эппендорфа. Добавьте два с половиной объема абсолютного этанола и 0,1 объема три моляра ацетата натрия рН 5,2.

Инкубировать не менее 20 минут при минус 80 градусах. Удалите этанол и высушите гранулы на воздухе. Повторное суспендирование гранул в 50 микролитрах TE. Для изучения их особого распределения на ДНК следует применять иммунопреципитацию хроматина.

На этом рисунке представлены типичные экспериментальные результаты, полученные методом ChIP-qPCR, которые демонстрируют временное обогащение гамма-гистонов AX в ответ на I-PpoI-индуцированное повреждение ДНК. В левой части изображения своевременно обнаруженный сигнал гамма-гистонов AX показан на стороне разрыва, в то время как в правой части распределение гамма-гистона AX представлено в контрольной области гена, в которой демонстрируемые разрывы не были индуцированы. Хотя репарации ДНК является относительно недавней областью исследований, наши знания быстро растут с помощью как биохимических, так и микроскопических методов.

Тем не менее, биохимические методы, такие как вестерн-блот, иммунопреципитация и масс-спектрометрия, требуют большого количества клеток. Процессы восстановления исследования представляют собой снимок желаемой клеточной популяции. Микроскопическое поле было революционизировано методами высокого разрешения, такими как микроскоп сверхвысокого разрешения, который позволяет визуализировать клеточные процессы, вызванные повреждением ДНК, на нуклеосомном уровне, а также обеспечивает точное картирование колокализации белка.

С другой стороны, иммунопреципитация хроматина является мощным инструментом, особенно путем объединения его с методами секвенирования для визуализации его общегеномной структуры связывания желаемых белков, связанных с репарацией ДНК, и двухцепочечных разрывов в областях хроматина или гетерохроматина.