Создание химер переднего мозга птиц для оценки развития лица
18 февраля 2021 г.
В этой статье описывается метод трансплантации тканей, который был разработан для проверки сигнальных и паттернирующих свойств базального переднего мозга во время черепно-лицевого развития.
Этот метод позволяет исследователям оценить взаимодействие тканей между базальным передним мозгом и лицом. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он изолирует базальный передний мозг для оценки и предотвращает загрязнение клетками нервного гребня, что может запутать анализ. Сложной частью этой техники является удаление переднего мозга у хозяина и замена его донорской тканью.
Продемонстрирует процедуру Диана Ху, научный сотрудник лаборатории доктора Ральфа Маркучио. Для начала подготовьте носитель DMEM с нейтральным красным цветом, стеклянной пипеткой для переноса и заточенным вольфрамом. С помощью шприца объемом 10 миллилитров и иглы 18 калибра удалите 0,5 миллилитра альбумина с заостренного конца яичной скорлупы.
Сделайте небольшое отверстие поверх скорлупы с помощью ножниц. Затем поместите кусок ленты поверх отверстия и вырежьте круглое отверстие, чтобы обнажить эмбрион. Окрасьте зародыш нейтральным красным цветом.
Собирают тканевые трансплантаты с левой стороны базального переднего мозга эмбрионов седьмой или восьмой стадии. Используйте изогнутые заостренные вольфрамовые иглы, чтобы аккуратно надрезать кусочек переднего мозга. Чтобы не включать нижележащую энтодерму, проведите иглу под передним мозгом параллельно оси нервной трубки.
Возьмите трансплантат у донорского эмбриона с помощью стеклянной пипетки для переноса и перенесите его в DMEM, содержащий нейтральный красный цвет, на две минуты, чтобы окрасить его. Затем поместите окрашенный трансплантат в DMEM, который не содержит нейтрального красного цвета, до тех пор, пока он не будет готов к приживлению. Инкубируйте оплодотворенные яйца от белой курицы породы Леггорн при температуре 37 градусов по Цельсию в увлажненной камере до седьмой-восьмой стадии Гамбургера-Гамильтона.
Экспонируйте эмбрионы, как было продемонстрировано ранее. Используя заостренные вольфрамовые иглы, подготовьте место трансплантата, разрезав, а затем удалив кусок базального переднего мозга размером 0,3 на 0,2 миллиметра для размещения трансплантата. Избегайте чрезмерного разрушения основной энтодермы, что будет очевидно, когда гранулы желтка начнут просачиваться через любой сделанный разрыв.
После переноса трансплантата хозяину расположите трансплантат так, чтобы заменить экстирпированный базальный передний мозг хозяина. Плотно наклейте ленту на отверстие и верните эмбрионы в инкубатор с температурой 37 градусов по Цельсию, пока они не будут готовы к анализу. Изначально химеры создавались путем пересадки тканей перепелов в эмбрионы птенцов.
С помощью антитела QCPN клетки перепелов визуализировали и отличали от тканей хозяина. Система перепелов-цыплят подтвердила, что весь трансплантат состоял только из нервной ткани и не был загрязнен другими типами клеток. Трансплантация тканей перепелов в эмбрионы уток привела к сильно деформированным химерам из-за более быстро развивающегося мозга перепелов.
Поэтому была проведена трансплантация тканей утки куриным эмбрионам. Полученные химеры утки-цыплят предполагают, что мозг участвует в регуляции морфологии. Цельная горная гибридизация C2 была использована для оценки экспрессии звукового ежа в химерах.
Подобно морфологии, выражение лица ежа Соника на утиной стороне химеры казалось более утиным Подготовка хост-сайта требует практики. Большое количество эмбрионов не выживает, поэтому создание большого количества химер может помочь обеспечить надлежащие образцы для анализа.
Этот метод позволил оценить, как сигналы от мозга формируют домен экспрессии ежа Sonic в лобноназальной эктодермальной зоне.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод трансплантации тканей, который позволяет исследователям оценивать взаимодействие между базальным передним мозгом и лицом в процессе краниофациального развития. Этот метод позволяет изолировать базальный передний мозг для анализа, предотвращая загрязнение клетками нервного гребня.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Развитие краниофациальных структур
- Методы трансплантации тканей
Теоретическая часть
- Базальный отдел переднего мозга играет критическую роль в развитии краниофациальных структур.
- Понимание взаимодействий между тканями имеет принципиальное значение для биологии развития.
- Загрязнение клетками нервного гребня может привести к искажению результатов анализа.
- Изоляция базального отдела переднего мозга позволяет более точно оценить его сигнальные свойства.
Цель исследования
- Исследовать сигнальные и паттернирующие свойства базального отдела переднего мозга.
- Разработать надежный метод трансплантации тканей.
- Углубить понимание механизмов развития краниофациальных структур.
Используемые методы
- Приготовление среды DMEM с нейтральным красным.
- Использование стеклянной переносной пипетки и заточенного вольфрама.
- Удаление альбумина из заостренного конца яичной скорлупы с помощью шприца.
- Замена переднего мозга реципиента донорской тканью.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно изолировать базальный отдел переднего мозга для последующего анализа.
- Демонстрация процедуры ученым-исследователем.
- Успешная оценка взаимодействия тканей без загрязнения образцов.
- Представление данных о роли базального отдела переднего мозга в развитии черепа и лица.
Выводы
- Метод трансплантации является ценным инструментом для изучения развития краниофациальных структур.
- Изоляция базального отдела переднего мозга повышает точность оценки процессов развития.
- Данный метод может быть применен в дальнейших исследованиях в области нейробиологии развития.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Этот метод позволяет проводить точную оценку тканевой сигнализации при развитии челюстно-лицевой области путем изолирования базального отдела переднего мозга от влияния нейронального гребня. Он способствует механическому снижению рисков при валидации мишеней, разъясняя, каким образом сигналы, исходящие из мозга, регулируют морфогенетические пути, такие как Sonic hedgehog в фронто-назальной эктодермальной зоне. Данный подход представляет собой релевантную для изучения заболеваний систему оценки путей развития с прогностической достоверностью на ранних этапах поиска.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы о взаимодействии тканей мозга и лица в процессе развития позвоночных.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность функциональной валидации мишеней путем изоляции свойств передачи сигналов в базальном переднем мозге.
- Прогностическая ценность: Повышает достоверность прогнозов, связывая манипуляции с базальным передним мозгом с изменениями в области экспрессии SHH.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Подготовка валидированных химерных систем для количественной оценки экспрессии морфогенов.
- Практическая ценность: Стандартизация трансплантации тканей для получения воспроизводимых результатов анализа при различных экспериментальных условиях.
- Масштабируемость: Обеспечение возможности создания множества химер для компенсации низкого уровня выживаемости и обеспечения достоверности анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает механизмы, выявленные на этапе фундаментальных исследований, с доклиническими моделями формирования структур черепа и лица.
- Механистическое снижение рисков: проясняет роль апстрим-регуляторов SHH — ключевого пути при моделировании врожденных нарушений развития.
- Релевантная модели болезни система: использование птичьих химер для изучения консервативных механизмов развития лица у позвоночных.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод подходит для использования в рамках начальных этапов поиска новых лекарственных средств, когда анализ взаимодействия с тканями позволяет подтвердить значимость мишени перед началом поиска ведущих соединений.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку гипотез о сигнальных центрах в краниофациальном морфогенезе.
- Готовность анализа: Позволяет создавать стандартизированные биологические системы для количественного анализа экспрессии SHH.
- Аналитика: Позволяет проводить гибридизацию in situ в целом препарате для измерения пространственных изменений экспрессии генов в качестве основного показателя.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает механистическую преемственность от трансплантации нервной ткани до формирования фенотипа лица.
- Корпоративное повторное использование: Создает многократную платформу для оценки специфического вклада тканей в пути развития.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет изоляции сигналов базального переднего мозга при развитии лицевого отдела.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость благодаря стандартизированным методам трансплантации и подготовки реципиента.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) за счет уточнения вышестоящих регуляторов доступных для лекарственного воздействия путей, таких как SHH.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе валидированных данных о взаимодействии тканей.
Особенности реализации
- Требуется опыт в микрохирургической обработке тканей и манипуляциях с эмбрионами птиц.
- Зависит от использования специализированных инструментов, включая заточенные вольфрамовые иглы и стеклянные переносящие пипетки.
- Необходимы стандартизированные протоколы инкубации и стадирования для эмбрионов-реципиентов и доноров.
- Требуется оптимизация подготовки места трансплантации для предотвращения вытекания желтка и обеспечения жизнеспособности реципиента.
- Ограничено низким уровнем выживаемости эмбрионов, что требует большого объема образцов для обеспечения достоверности анализа.
