Оценка мочевых нанокристаллов у людей с использованием маркировки флуорофора кальция и анализа отслеживания наночастиц

Этот протокол может специфически обнаруживать кальцийсодержащие нанокристаллы в моче человека. Этот метод потенциально может быть полезен для прогнозирования ранних стадий образования камней в почках, а также других заболеваний, связанных с кристаллической мочевиной. Продемонстрировать процедуру будет доктор Парвин Кумар, исследователь IV в моей лаборатории.

Запрочем участникам потреблять диету с низким содержанием оксалатов в течение трех дней и голодать на ночь. Затем соберите 24-часовой образец мочи у участников, прежде чем они потребляют оксалатную нагрузку. Кормите участников смузи, содержащим фрукты и овощи с оксалатной нагрузкой около восьми миллимолей.

Попробуйте участников собрать мочу в течение 24 часов после потребления оксалатов и вернуть ее на следующий день. Поддерживайте все образцы мочи при комнатной температуре перед обработкой. Измерьте и запишите рН мочи и объем образцов мочи.

Тщательно перемешайте и добавьте 50 миллилитров мочи в меченую стерильную коническую трубку размером 50 миллилитров. Центрифугировать образец в 1 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре с помощью настойной центрифуги. Выбросьте супернатант, затем промыть и снова суспендировали гранулу пятью миллилитрами 100% этанола.

Центрифугировать образец в 1 200 раз G в течение 10 минут при комнатной температуре с помощью настойной центрифуги. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу в одном миллилите 100% этанола. Храните образец при температуре минус 20 градусов Цельсия для последующей обработки или немедленно приступайте к окрашиванию образцов.

Разбавьте наночастицы золота наночастиц нанометрового размера в сверхчистой воде в соотношении 1:1 000 и используйте их для оптимизации настроек на приборе. Разбавьте образцы мочи 20 раз в воде перед окрашиванием пятью миллимолярами Fluo-4 AM в течение 30 минут в темноте и проанализируйте образцы с помощью NTA. Готовят кристаллы оксалата кальция и фосфата кальция, как описано в рукописи текста, до анализа NTA.

Включите компьютер и прибор, затем откройте программное обеспечение и включите фотокамеру. Щелкните значок захвата в левом верхнем углу окна, чтобы запустить режим захвата. Очистите платформу, сначала закачивая в нее воздух с помощью одного миллилитра шприца, пока платформа не окажется чистой.

Осторожно добавьте воду в аппарат два-три раза и используйте еще один миллилитр шприца, чтобы удалить пузырьки воздуха. Как только платформа будет очищена, добавьте воду и проверьте наличие загрязнений на поверхности, просмотрев камеру, а затем добавьте наночастицы золота в качестве элемента управления в инжектор насоса загрузки образцов для настройки прибора. Отрегулируйте уровень камеры на экране или на ручке в правой части инструмента, пока изображение не начнет отображать цветные пиксели, затем уменьшите уровень камеры.

Затем настройте экран, чтобы оптимизировать изображение. Щелкните левой кнопкой мыши на видеоизоблике. Удерживайте левую кнопку мыши и перетащите изображение вверх и вниз, чтобы получить весь вид.

Настройте скорость инфузии и сфокусировать камеру так, чтобы наночастицы золота были видны на экране камеры. Установите высокую скорость инфузии для первоначальной настройки, чтобы обеспечить обнаружение наночастиц золота. После обнаружения уменьшите скорость до 50 микролитров в минуту, чтобы визуализировать наночастицы золота.

Отрегулируйте уровень камеры, чтобы визуализировать частицы. Для неокрашированных образцов отрегулируйте коэффициент усиления экрана на пятом уровне, чтобы достичь фокусировки камеры, и установите уровень камеры на восемь. После установки фокуса запишите образец.

После оптимизации снова очистите аппарат водой перед оценкой других образцов, чтобы убедиться, что трубка чистая и частицы отсутствуют. Для анализа окрашенных образцов отрегулируйте камеру в положение фильтра, содержащего подходящий флуоресцентный фильтр, и загрузите разбавленные и окрашенные образцы на инжектор насоса загрузки образцов, уменьшив скорость до 20 микролитров в минуту для анализа. Отрегулируйте коэффициент усиления экрана до пяти, а уровень камеры до 13.

Сохраняйте данные после каждого измерения. Рассчитайте среднее количество наночастиц для всех пяти показаний для каждого отдельного образца и проанализируйте данные, используя стандартное отклонение или стандартную погрешность среднего значения. Используйте Т-тесты для парного анализа.

Fluo-4 AM был способен связываться как с кристаллами оксалата кальция, которые были размером от 50 до 270 нанометров и имели среднюю концентрацию 1 260 миллионов частиц на миллилитр, так и кристаллами фосфата кальция, которые составляли от 30 до 225 нанометров и имели среднюю концентрацию 2 220 миллионов частиц на миллилитр. 24-часовые образцы мочи, собранные до оксалатной нагрузки, содержали некоторые мочевые нанокристаллы размером от 110 до 300 нанометров. Напротив, наблюдалось значительное увеличение количества мочевых нанокристаллов, присутствующих в образцах постоксалата.

Чтобы подтвердить воспроизводимость метода, образцы были измерены три раза, и не было никаких существенных изменений в технических репликах. При попытке использовать этот протокол могут возникнуть некоторые трудности с добавлением образцов без пузырьков в машину. Чтобы предотвратить это, добавьте воздух и воду в машину, а затем медленно добавьте образцы.

Кроме того, убедитесь, что вы постоянно контролируете свои образцы и что в них нет пузырьков. Этот новый метод будет протестирован на людях с почечно-каменной болезнью оксалата кальция для мониторинга прогрессирования заболевания и / или для прогнозирования риска камней в почках.