Функциональная характеристика эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 человека
9 июня 2021 г.
Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.
Этот протокол важен, потому что он использует материал пациента. Если у пациента есть заболевание, использование его клеток должно более точно отражать биологическую реакцию пациента. Эта техника проста в выполнении, понятна и не требует сложного оборудования.
Эти методы могут быть использованы для диагностики, например, для доказательства того, что мутация RYR1 функционально изменяет гомеостаз кальция, а также для проверки потенциальной терапевтической функции соединения. В зависимости от знаний и технических навыков отдельного исследователя, тестовые эксперименты должны быть выполнены до того, как будут использованы фактические образцы пациентов. Для мониторинга изменений внутриклеточной концентрации кальция в В-трансформированных В-лимфоцитах повторно суспендируют увековеченные В-клетки в однократном размере от 10 до седьмых клеток на миллилитр концентрации в растворе Кребса Рингера и Фура-2 АМ до конечной концентрации пяти микромоляров для 30-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия.
В конце инкубации соберите клетки путем центрифугирования и повторно суспендируйте гранулу в свежем растворе Кребса Рингера в два раза по 10-шестую клетку на миллилитр концентрации. Непосредственно перед началом эксперимента центрифугируйте клетки снова и быстро повторно суспендируйте клетки в 1,5 миллилитра раствора Кребса Рингера, дополненного 0,5-миллимолярным EGTA, но без добавления кальция. Перенесите ячейки в стеклянную трехмиллилитровую спектрофлуорометрическую кювету и запишите коэффициент флуоресценции на спектрофлуорометре, оснащенном магнитной мешалкой, установленной на максимальной скорости и 37 градусах Цельсия в течение примерно 30 секунд.
Чтобы оценить реакцию высвобождения кальция в отдельных клетках, нанесите один раз 106 загруженных клеток Fura-2 AM в одном миллилитре раствора Кребса Рингера, дополненного одномимолярным хлоридом кальция, на отдельные стеклянные крышки с поли-L-лизином покрытием и инкубируйте крышку при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе клеточной культуры в течение 30 минут. Когда клетки прикрепятся, поместите крышку в перфузионную камеру и начните перфузию клеток на двух миллилитрах раствора Кребса Рингера, дополненного одним миллимоляром кальция в минуту. Используя перевернутый флуоресцентный микроскоп, оснащенный 40-кратным масляным погружным объективом и соответствующими фильтрами, записывайте онлайн-измерения с помощью программно управляемой камеры с зарядовой связью с интервалом в одну секунду при фиксированном времени экспозиции.
Для достижения стимуляции клеток используйте стимулятор перфузии клеток с 12 клапанами для добавления различных концентраций агониста. Чтобы изолировать миотрубы из биопсии мышц человека, сначала промыть биопсию стерильным PBS, чтобы удалить избыток крови, прежде чем измельчать ткань на небольшие, от 0,5 до одного миллиметра фрагменты. Поместите два-три фрагмента в отдельные вкладыши в каждую лунку шестилуночной тканевой культуральной пластины, содержащей 1,5 миллилитра среды роста мышц человека на лунку и 500 микролитров среды на вставку, и поместите пластину в инкубатор клеточной культуры.
Для измерения изменений экспрессии кальция в миотрубах человека, когда можно наблюдать многоядерные миотрубки, замените супернатанты культуры миотуб свежей дифференцирующей средой, дополненной 10 микролитрами одномимолярного Fura-2 AM для 30-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации переложите одну стеклянную покровную скользящую культуру в перфузионную камеру и промойте клетки раствором Кребса Рингера, дополненным двухмиллимолярным хлоридом кальция. Затем выполните онлайн-измерения кальция, как показано с использованием 20-кратного объектива погружения в воду.
В этом репрезентативном анализе наблюдалось быстрое увеличение кальция в УВ-увековеченных В-лимфоцитах после добавления агониста, который медленно снижался до уровней покоя с течением времени. В аналогичном эксперименте добавление 400-наномолярного тапсигаргина вызывало большой переходный процесс кальция, который достигал пикового значения флуоресценции в 2,4 произвольных единицы. Это значение флуоресценции считалось равным 100%, когда была построена соответствующая кривая дозового ответа.
В этом анализе увековеченные В-клетки стимулировали пятимиллимолилярным кофеином в течение 20 секунд, что приводило к немедленному увеличению коэффициента флуоресценции 340 и 380 нанометров. Для каждой тестируемой концентрации кофеина был рассчитан и использован для построения кривой дозовой реакции пик, вызванный кофеином, в соотношении 340 на 380 нанометров флуоресценции. Высвобождение кальция из дифференцированных миотруб также может быть оценено в ответ на промывку хлоридом калия, различными концентрациями агониста и / или кофеина, и могут быть сгенерированы кривые нормальной реакции дозы.
Важно убедиться, что ячейки правильно загружены Fura-2 и что обе 340 и 380-нанометровые длины волн реагируют на добавление агониста. Внутриклеточные измерения кальция с флуоресцентными показателями кальция могут быть исследованы в большинстве клеток млекопитающих и могут быть применены для изучения внутриклеточных изменений кальция в ответ на различные раздражители.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описаны методы изучения функциональных эффектов мутаций RYR1 в клетках, полученных от пациентов. Используя иммортализованные вирусом Эпштейна-Барр B-лимфоциты человека и сателлитные клетки, полученные из биоптата мышц, исследователи могут получить представление о гомеостазе кальция и потенциальных терапевтических воздействиях.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Генетика
Теоретическая часть
- Мутации RYR1 связаны с различными мышечными заболеваниями.
- Понимание гомеостаза кальция имеет решающее значение для диагностики этих состояний.
- Клетки, полученные от пациентов, обеспечивают более точный биологический ответ.
- В данном исследовании используются простые методы, не требующие сложного оборудования.
Цель исследования
- Оценить функциональное влияние мутаций RYR1.
- Оценить биологический ответ клеток, полученных от пациентов.
- Изучить потенциальные варианты терапии расстройств, связанных с RYR1.
Используемые методы
- Выделение B-лимфоцитов пациентов, трансформированных EBV.
- Инкубация клеток с Fura-2 AM для мониторинга уровней кальция.
- Использование раствора Кребса-Рингера для ресуспендирования клеток.
- Тестирование соединений для оценки их терапевтического потенциала.
Основные результаты
- Продемонстрированы функциональные изменения гомеостаза кальция, вызванные мутациями RYR1.
- Подтверждена применимость клеток, полученных от пациентов, для точной биологической оценки.
- Предложена доступная методика для исследователей.
- Обозначен потенциал проведения терапевтического тестирования с использованием образцов пациентов.
Выводы
- Данный протокол предлагает надежный метод изучения мутаций RYR1.
- Использование клеток, полученных от пациентов, повышает значимость полученных результатов.
- Будущие исследования могут опираться на эти методы для поиска новых способов терапии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Функциональная характеристика эндогенно экспрессируемых вариантов RYR1 в клетках, полученных от пациентов, позволяет снизить механистические риски при выборе мишеней для терапии нервно-мышечных заболеваний путем установления связи между генотипом и фенотипами кальциевой сигнализации. Данный подход способствует валидации мишеней и разработке методов анализа патологий, связанных с RYR1, обеспечивая прогностическую достоверность при оценке патогенности вариантов. Метод облегчает идентификацию трансляционных биомаркеров и обеспечение преемственности доклинических моделей с использованием B-лимфоцитов человека и дифференцированных миотрубок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: проверка терапевтических гипотез путем измерения внутриклеточного потока ионов кальция в вариантах RYR1 с эндогенной экспрессией.
- Операционная ценность: обеспечение биологического снижения рисков за счет прямого сравнения эффектов вариантов в клетках пациентов и здоровых контрольных группах.
- Прогностическая ценность: поддержка сортировки портфеля препаратов путем количественной оценки функционального влияния мутаций RYR1 на гомеостаз кальция.
Скрининг и разработка методов анализа
- Готовность анализа: подготовка валидированных биологических систем для скрининга соединений с использованием B-лимфоцитов, трансформированных EBV и нагруженных Fura-2 AM, а также миотрубок.
- Количественные данные: построение кривых «доза — ответ» на фармакологические агонисты (например, кофеин, тапсигаргин) для стандартизированного измерения высвобождения кальция.
- Повторное использование платформы: поддержка масштабируемых рабочих процессов скрининга с помощью спектрофлуориметрии или флуоресцентной микроскопии единичных клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: использование клеток пациентов с предрасположенностью к злокачественной гипертермии, стержневыми миопатиями и центронуклеарной миопатией для моделирования патофизиологии человека.
- Трансляционная преемственность: обеспечение перехода от фундаментальных исследований к доклинической валидации за счет сохранения эндогенных уровней экспрессии и нативного генетического фона.
- Оптимизация рисков при разработке: обоснование решений о целесообразности дальнейшего исследования (go/no-go) путем выявления непатогенных вариантов и подтверждения функционального воздействия мутаций, связанных с заболеванием.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска, позволяя проводить тестирование гипотез о функции варианта RYR1 до начала этапов идентификации перспективных соединений.
- Биологические исследования: способствует уточнению сигнальных путей и снижению механистических рисков за счет прямого измерения вызванного агонистом высвобождения кальция в клетках, полученных от пациентов.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа с помощью рациометрического измерения флуоресценции Fura-2 AM в контролируемых перфузионных системах.
- Аналитика: обеспечивает количественное измерение зависимой переменной (внутриклеточный [Ca²⁺]), что позволяет сравнивать эффекты вариантов на различных генетических фонах.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинических работ за счет использования человеческих сателлитных клеток, дифференцированных в миотрубки в физиологических условиях.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность многократного использования метода для скрининга вариантов в рамках программ по изучению нервно-мышечных заболеваний без необходимости применения систем гиперэкспрессии.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность путем установления связи между генотипом RYR1 и фенотипом кальциевой сигнализации в нативном клеточном контексте.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость за счет определенного способа загрузки клеток, перфузии агониста и рациометрического детектирования флуоресценции.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go), предоставляя функциональные доказательства патогенности варианта, что снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритезацию терапевтических средств, направленных на RYR1, с учетом рисков на основе валидированных функциональных анализов.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами клеток, флуоресцентным кальциевым имиджингом и перфузионной стимуляцией агонистами.
- Необходимо наличие спектрофлуориметра или флуоресцентного микроскопа с двухволновым возбуждением (340/380 nm) и детектированием эмиссии.
- При сравнении результатов пациентов с разным генетическим фоном, имеющих один и тот же вариант RYR1, требуется стандартизация между лабораториями.
- Вопросы адаптации метода включают оптимизацию нагрузки Fura-2 AM и диапазонов концентрации агонистов для B-лимфоцитов, трансформированных EBV, по сравнению с дифференцированными миотрубками.
- Практические ограничения включают вариабельность жизнеспособности клеток пациентов и необходимость сравнения со здоровым контролем для отличия специфических эффектов варианта от фонового шума.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:00
Intracellular Cell Culture Ca2+ Measurement
2:30
Intracellular Single Cell Ca2+ Measurement
3:56
Human Myotube Preparation
4:40
Human Myotube Inducible Calcium ([Ca2+]i) Measurement
5:33
Results: Representative Single Cell Ca2+ Release in EBV-Immortalized Human B Cells and Isolated Human Myotubes
7:11
Conclusion
