TGF-β-опосредованный переход эндотелия в мезенхимальный переход (EndMT) и функциональная оценка эффекторов EndMT с использованием редактирования генов CRISPR/Cas9

Переход эндотелия в мезенхимальное — это клеточный процесс, при котором эндотелиальные клетки изменяют свою морфологию булыжника в фибробластоподобный фенотип. И цитокин TGF-бета, трансформирующий фактор роста бета, является основным драйвером этого перехода. Анализ изменений морфологии клеток и уровней экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных маркеров позволяет оценить возникновение эндотелиального перехода в мезенхимальный.

Новые данные связывают процесс перехода эндотелия в мезенхимальное с различными заболеваниями, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания и фиброз. И данные свидетельствуют о том, что вмешательство может принести терапевтическую пользу. Стимулируя процесс перехода эндотелия в мезенхимальное, который происходит во время эмбриогенеза и развития органов, мы можем регенерировать ткани, полученные из мезенхимальных костяков, таких как хрящи, кости и мышцы.

Для обнаружения внутриклеточного белка путем иммунофлюоресцентного окрашивания необходима пермеабилизация клеток с использованием 0,1% тритона X-100, чтобы антитела проходили через клеточные мембраны. С помощью этой видеодемонстры исследователи получат хорошее представление о том, как исследовать роль цитокинов, таких как TGF-бета, в переходе эндотелия в мезенхимальное. Во-первых, семена 1 x 10^5 зеркально отражают эндотелиальные клетки MS1 островков поджелудочной железы в DMEM, дополненные 10% FBS и 100 единицами на миллилитр пенициллина и стрептомицина на 0,1% желатиновой культуральной пластине.

После ночной инкубации в инкубаторе клеточной культуры промыть клетки PBS перед обработкой двумя миллилитрами 0,25% трипсина, 0,02% раствором ЭДТА в течение двух минут при 37 градусах Цельсия. Когда клетки начали отсоединяться, закаляют реакцию пятью миллилитрами полной питательной среды и переносят полученную клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку для центрифугирования. Повторно суспендируют гранулу в четырех миллилитрах свежей полной среды для подсчета.

И посейте 1 X 10^3 клетки на кубический сантиметр в новый контейнер для культуры клеток. После ночной культуры обработать две скважины пятью микромолярными ингибиторами киназы TGF-бета-рецепторов SB-431542 и две скважины с контролем растворителя DMSO. И поместите клетки в инкубатор клеточной культуры на 30 минут.

В конце инкубации обработайте две скважины с управлением транспортным средством и две скважины с TGF-beta 2. Через три дня используйте инвертированный микроскоп для изучения морфологии клеток каждой группы лечения клеток при визуализации brightfield. Чтобы оценить изменения маркеров, связанных с эндмТ, путем иммунофлуоресцентного окрашивания, отсоедьте клетки от соответствующей клеточной культуры MS1, как показано на демонстрации.

И посейте клетки с концентрацией 1,9 X 10^3 клеток на 12-миллиметровые круглые покровные стекла с желатиновым покрытием, помещенные в отдельные колодцы 24-скважинной пластины. После ночной культуры обработайте клетки одним нанограммовым миллилитром TGF-бета-2 в течение трех дней. В конце инкубации промыть клетки PBS и зафиксировать обработанные культуры 300 микролитрами 4%-формальдегида на лунку в течение 10 минут при комнатной температуре.

В конце фиксации промыть клетки три раза PBS перед пермеабилизацией клеток 300 микролитрами 0,1% Triton X-100 и PBS на лунку в течение 10 минут при комнатной температуре. В конце инкубации промыть клетки три раза в PBS и заблокировать клетки с 3% BSA в PBS. Через 45 минут при комнатной температуре маркируют клетки первичными антителами PECAM-1 и SM22-альфа в течение 45 минут при комнатной температуре с последующей тремя промывками в PBS.

После последней промывки инкубируют клетки с соответствующими вторичными антителами в течение 45 минут при комнатной температуре и трижды промывайте клетки PBS перед установкой клеток с помощью монтажной среды, дополненной DAPI, и крышки. Затем запечатайте края крышки прозрачным лаком для ногтей и визуализируйте экспрессию клеточного маркера с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии с использованием соответствующих фильтров в соответствии со стандартными протоколами визуализации. После трех дней лечения TGF-бета-2 эндотелиальные клетки MS1 теряют свою булыжную структуру и дифференцируются в веретенообразные мезенхимально-подобные клетки.

Эта дифференцировка, индуцированная TGF-бета-2, подавляется, когда клетки подвергаются воздействию ингибитора киназы TGF-бета-рецепторов SB-431542. Экспрессия эндотелиального белка PECAM-1 значительно снижается после стимуляции TGF-бета-2, в то время как мезенхимальный фактор SM-22 альфа глубоко урегулируемый. Кроме того, Улитка заметно урегулируема воздействием TGF-beta 2, в то время как экспрессия Slug не затрагивается.

Как было замечено, редактирование гена CRISPR-Cas9 может быть использовано для облегчения введения двух независимых одноповодных РНК Snail в Cas9-экспрессирующие клетки MS1 для нарушения экспрессии улитки. Нокаут улитки достаточен для ингибирования фибробластоподобной морфологии клеток, обусловленной TGF-бета-2 в клетках MS1, и для блокирования Опосредованного TGF-бета-2 снижения PECAM-1 и альфа-усиления SM-22. Оценка изменений в морфологии клеток и экспрессии эндотелиальных и мезенхимальных маркеров иммунофлуоресценцией может быть дополнительно подтверждена путем измерения экспрессии этих маркеров на количественной ПЦР в анализе вестерн-блот.

Этот метод обнаружения эндотелиального перехода в мезенхимальный позволил исследователям исследовать это возникающее значение как физиологический процесс, который происходит при нескольких заболеваниях.