Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света
February 26th, 2021
Мы представляем исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на diamond beamline I24.
Последовательная синхротронная кристаллография, или SSX, является относительно новой и быстро развивающейся областью MX.Она очень хорошо подходит для экспериментов с низкой дозой и комнатной температурой, но, возможно, самое главное, она действительно хорошо подходит для следования динамике. Это позволяет снимать стоп-моушн фильмы о белках в действии. В I24 доступно несколько режимов SSX.
Этот протокол фокусируется на SSX с фиксированной целью, что позволяет проводить широкий спектр последовательных экспериментов с использованием ограниченного количества образца. Кремниевые чипы могут быть повреждены при загрузке и очистке, если вы с ними не знакомы. Кроме того, протокол выравнивания чипа является совершенно новым для многих кристаллографов, а обработка данных немного отличается от ваших стандартных данных о вращении.
Чтобы подготовить держатель для чипов, разрежьте два листа полиэфирной фольги примерно на квадраты размером 6 на 6 сантиметров и поместите листы поверх двух опорных пластин. Используя металлические уплотнительные кольца, закрепите листы на месте, затем осторожно потяните за лишнюю фольгу, чтобы удалить любые складки. Затем выберите кремниевый чип с соответствующими размерами отверстий относительно размера анализируемых кристаллов.
Тлеющий разряд чипа в течение 25 секунд при 0,39 миллибар, с током 15 миллиампер. Используйте пинцет, чтобы поместить кремниевый чип на ступень загрузки чипа, с поднятыми стержнями, обращенными вниз. Затем, используя пипетку, нанесите 200 микролитров микрокристаллического суспензии на плоскую сторону чипа, распределив суспензию, чтобы покрыть все городские кварталы чипа.
Если чип поврежден, закройте любые отверстия небольшим кусочком полиэфирной фольги, чтобы обеспечить равномерное применение вакуума. Затем примените мягкий вакуум, чтобы аспирировать всю лишнюю жидкость через чип. Извлеките чип из стадии загрузки чипа и тщательно промойте нижнюю часть чипа фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость.
Поместите загруженный чип на большую половину держателя чипа между направляющими метками, плоской стороной вниз. Поместите маленькую половину держателя чипа на чип, чтобы запечатать его. Две половинки держателя чипа должны защелкнуться на месте.
Затем, используя шестигранные болты, надежно закрепите чип на месте. Чтобы выровнять чип, удерживайте держатель чипа под углом 30 градусов при приближении к креплению. Затем используйте кинематические крепления, чтобы поместить загруженный чип на ступень XYZ на линии луча.
Когда магниты соприкоснутся, позвольте держателю чипа вращаться параллельно потоку и нажмите на место. После того, как чип размещен, используйте систему просмотра линии луча по оси и графический пользовательский интерфейс выравнивания чипа, чтобы найти верхнюю левую фидуциаль чипа. Чтобы сосредоточиться на фидуциальном 0 в X, Y и Z, перемещайтесь внутрь и вне фокуса, чтобы выровнять Z, вверх и вниз, чтобы выровнять Y, а также влево и вправо, чтобы выровнять X.Затем нажмите установить Fiducial 0"После выравнивания фидуциального 1 и 2 с рентгеновским лучом таким же образом нажмите кнопку Создать систему координат", чтобы создать матрицу координат.
Затем нажмите «Проверка блока», чтобы переместить стадию XYZ в первую колодцу каждого городского квартала. Если рентгеновское перекрестие совпадает с диафрагмами, чип выравнивается. В этом графическом представлении результатов поиска пятен с помощью DIALS можно наблюдать график обновления скорости попадания.
При нажатии на удар соответствующее дифракционное изображение будет отображаться в средстве просмотра изображений DIALS. В этой таблице можно визуализировать текущие показатели индексации и интеграции, которые обновляются в режиме реального времени по мере сбора данных во время посещения. Визуализация параметров ячейки блока позволяет выявить полиморфы.
Двумерные графики полезных параметров также могут быть получены для выявления изменений, которые возникают из-за эффектов нагрузки или обезвоживания. Стереографические проекции могут выявить наличие или отсутствие предпочтительных ориентаций, которые могут быть возвращены в протокол загрузки. Например, в этой проекции можно наблюдать эффекты перегрузки чипа кристаллами лизоцима.
При загрузке чипа медленно используйте палец, чтобы положить пипетку над чипом. Это предотвращает прикосновение к чипу и случайное пронзание отверстий в кремнии. При обработке данных используйте доступные автоматизированные конвейеры.
Это даст вам хорошее представление о том, как продвигается ваш эксперимент, и нужно ли вам что-то варьировать. Этот метод может быть применен к любой белковой системе, которая может кристаллизоваться в значительных количествах. И реакция может быть спровоцирована легкими рентгеновскими лучами или быстрым перемешиванием.
Динамические исследования ряда структур могут дать представление о том, как функционируют белки.
Обзор
Эта статья предоставляет исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на источнике Diamond I24. Она акцентирует внимание на методологии проведения экспериментов с ограниченным количеством образцов, обеспечивая целостность чипы.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Кристаллография
- Динамика белков
Фон
- Последовательная синхротронная кристаллография (SSX) является развивающейся областью в макромолекулярной кристаллографии.
- Она подходит для экспериментов с низкой дозой и при комнатной температуре.
- SSX позволяет проводить динамические исследования белков, обеспечивая визуализацию их действий.
- Последовательная SSX с фиксированной целью может эффективно использовать ограниченные количества образцов.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол для последовательной SSX с фиксированной целью на источнике Diamond I24.
- Обеспечить правильную подготовку и выравнивание чипы для оптимального сбора данных.
- Выделить различия в обработке данных по сравнению со стандартными вращающимися данными.
Используемые методы
- Подготовка силоновых чипы с использованием полиэстеровой фольги и методов герметизации.
- Нанесение шлика микрокристаллов на чипы и вакуумная аспирация.
- Выравнивание чипы с использованием графического интерфейса пользователя на источнике.
- Визуализация данных в реальном времени и их обработка с использованием автоматизированных конвейеров.
Основные результаты
- Успешное выравнивание чипы приводит к точному сбору данных.
- Мониторинг индексации и скорости интеграции в реальном времени во время экспериментов.
- Визуализация параметров ячейки решетки показывает полиморфы и эффекты загрузки.
- Динамические исследования дают представление о функциональности белков.
Выводы
- Протокол повышает эффективность экспериментов с последовательной SSX с фиксированной целью.
- Правильное обращение с чипами и их выравнивание являются ключевыми для успешного сбора данных.
- Динамические исследования с использованием SSX могут значительно продвинуть наше понимание поведения белков.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Fixed-target serial synchrotron crystallography enables structural biologists to conduct dynamic studies of proteins using limited sample quantities, supporting target validation through high-resolution structural insights. This method reduces sample consumption while maintaining data quality, which is critical for early-stage discovery where protein expression and purification are bottlenecks. By facilitating room-temperature and time-resolved experiments, it enhances mechanistic understanding of protein function, informing lead optimization and de-risking efforts in preclinical development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing protein conformations in action, supporting functional target validation.
- Operational Value: Reduces dependency on large crystal volumes, allowing screening of challenging targets with limited expression yields.
- Predictive Confidence: Provides structural data that informs binding site characterization and mechanism of action, improving target selection decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative electron density maps from microcrystals, enabling precise ligand-binding assessments.
- Operational Value: Standardizes sample mounting and alignment via chip-based systems, improving reproducibility across screening campaigns.
- Assay Readiness: Produces real-time hit-rate and indexing metrics that support go/no-go decisions during fragment or compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Reveals polymorphic forms and conformational changes that may impact drug binding or stability, informing formulation strategies.
- Operational Value: Captures time-resolved structural data that can correlate with functional assays, strengthening translational biomarker alignment.
- Risk Mitigation: Identifies loading-induced artifacts or dehydration effects early, reducing risk of misinterpretation in downstream optimization.
Pipeline & Workflow Integration
Fixed-target SSX integrates into the discovery workflow following target identification and assay development, providing structural insights that guide lead identification and preclinical validation. It supports iterative design-make-test-analyze cycles by delivering rapid structural feedback on compound binding and protein dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing ligand-induced conformational changes and protein dynamics relevant to mechanism of action.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chip preparation and alignment, ensuring consistent data quality across compound screens.
- Analytics: Delivers quantitative outputs including unit cell parameters, hit rates, and integration metrics that allow objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural observations to functional outcomes by revealing dynamics that may influence bioavailability or target engagement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing revalidation efforts in multi-project environments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by providing high-resolution, time-resolved structural data under near-physiological conditions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized chip handling, alignment protocols, and automated data processing pipelines.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing sample consumption and enabling rapid iteration in structural optimization campaigns.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing mechanistic ambiguity in target-ligand interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in macromolecular crystallography and familiarity with synchrotron-based sample handling techniques.
- Depends on access to beamline infrastructure with kinematic mounting, on-axis viewing, and automated data pipelines such as DIALS.
- Necessitates cross-team standardization of chip preparation, vacuum aspiration, and alignment procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations for different crystal sizes and space groups, requiring adjustment of aperture selection and spreading techniques.
- Includes practical limitations such as chip fragility during loading and cleaning, and sensitivity to dehydration effects that may alter crystal quality over time.
