Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Мы представляем исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на diamond beamline I24.

Последовательная синхротронная кристаллография, или SSX, является относительно новой и быстро развивающейся областью MX.Она очень хорошо подходит для экспериментов с низкой дозой и комнатной температурой, но, возможно, самое главное, она действительно хорошо подходит для следования динамике. Это позволяет снимать стоп-моушн фильмы о белках в действии. В I24 доступно несколько режимов SSX.

Этот протокол фокусируется на SSX с фиксированной целью, что позволяет проводить широкий спектр последовательных экспериментов с использованием ограниченного количества образца. Кремниевые чипы могут быть повреждены при загрузке и очистке, если вы с ними не знакомы. Кроме того, протокол выравнивания чипа является совершенно новым для многих кристаллографов, а обработка данных немного отличается от ваших стандартных данных о вращении.

Чтобы подготовить держатель для чипов, разрежьте два листа полиэфирной фольги примерно на квадраты размером 6 на 6 сантиметров и поместите листы поверх двух опорных пластин. Используя металлические уплотнительные кольца, закрепите листы на месте, затем осторожно потяните за лишнюю фольгу, чтобы удалить любые складки. Затем выберите кремниевый чип с соответствующими размерами отверстий относительно размера анализируемых кристаллов.

Тлеющий разряд чипа в течение 25 секунд при 0,39 миллибар, с током 15 миллиампер. Используйте пинцет, чтобы поместить кремниевый чип на ступень загрузки чипа, с поднятыми стержнями, обращенными вниз. Затем, используя пипетку, нанесите 200 микролитров микрокристаллического суспензии на плоскую сторону чипа, распределив суспензию, чтобы покрыть все городские кварталы чипа.

Если чип поврежден, закройте любые отверстия небольшим кусочком полиэфирной фольги, чтобы обеспечить равномерное применение вакуума. Затем примените мягкий вакуум, чтобы аспирировать всю лишнюю жидкость через чип. Извлеките чип из стадии загрузки чипа и тщательно промойте нижнюю часть чипа фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость.

Поместите загруженный чип на большую половину держателя чипа между направляющими метками, плоской стороной вниз. Поместите маленькую половину держателя чипа на чип, чтобы запечатать его. Две половинки держателя чипа должны защелкнуться на месте.

Затем, используя шестигранные болты, надежно закрепите чип на месте. Чтобы выровнять чип, удерживайте держатель чипа под углом 30 градусов при приближении к креплению. Затем используйте кинематические крепления, чтобы поместить загруженный чип на ступень XYZ на линии луча.

Когда магниты соприкоснутся, позвольте держателю чипа вращаться параллельно потоку и нажмите на место. После того, как чип размещен, используйте систему просмотра линии луча по оси и графический пользовательский интерфейс выравнивания чипа, чтобы найти верхнюю левую фидуциаль чипа. Чтобы сосредоточиться на фидуциальном 0 в X, Y и Z, перемещайтесь внутрь и вне фокуса, чтобы выровнять Z, вверх и вниз, чтобы выровнять Y, а также влево и вправо, чтобы выровнять X.Затем нажмите установить Fiducial 0"После выравнивания фидуциального 1 и 2 с рентгеновским лучом таким же образом нажмите кнопку Создать систему координат", чтобы создать матрицу координат.

Затем нажмите «Проверка блока», чтобы переместить стадию XYZ в первую колодцу каждого городского квартала. Если рентгеновское перекрестие совпадает с диафрагмами, чип выравнивается. В этом графическом представлении результатов поиска пятен с помощью DIALS можно наблюдать график обновления скорости попадания.

При нажатии на удар соответствующее дифракционное изображение будет отображаться в средстве просмотра изображений DIALS. В этой таблице можно визуализировать текущие показатели индексации и интеграции, которые обновляются в режиме реального времени по мере сбора данных во время посещения. Визуализация параметров ячейки блока позволяет выявить полиморфы.

Двумерные графики полезных параметров также могут быть получены для выявления изменений, которые возникают из-за эффектов нагрузки или обезвоживания. Стереографические проекции могут выявить наличие или отсутствие предпочтительных ориентаций, которые могут быть возвращены в протокол загрузки. Например, в этой проекции можно наблюдать эффекты перегрузки чипа кристаллами лизоцима.

При загрузке чипа медленно используйте палец, чтобы положить пипетку над чипом. Это предотвращает прикосновение к чипу и случайное пронзание отверстий в кремнии. При обработке данных используйте доступные автоматизированные конвейеры.

Это даст вам хорошее представление о том, как продвигается ваш эксперимент, и нужно ли вам что-то варьировать. Этот метод может быть применен к любой белковой системе, которая может кристаллизоваться в значительных количествах. И реакция может быть спровоцирована легкими рентгеновскими лучами или быстрым перемешиванием.

Динамические исследования ряда структур могут дать представление о том, как функционируют белки.