Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света
26 февраля 2021 г.
Мы представляем исчерпывающее руководство по подготовке образцов с фиксированной целью, сбору данных и обработке данных для последовательной синхротронной кристаллографии на diamond beamline I24.
Последовательная синхротронная кристаллография, или SSX, является относительно новой и быстро развивающейся областью MX.Она очень хорошо подходит для экспериментов с низкой дозой и комнатной температурой, но, возможно, самое главное, она действительно хорошо подходит для следования динамике. Это позволяет снимать стоп-моушн фильмы о белках в действии. В I24 доступно несколько режимов SSX.
Этот протокол фокусируется на SSX с фиксированной целью, что позволяет проводить широкий спектр последовательных экспериментов с использованием ограниченного количества образца. Кремниевые чипы могут быть повреждены при загрузке и очистке, если вы с ними не знакомы. Кроме того, протокол выравнивания чипа является совершенно новым для многих кристаллографов, а обработка данных немного отличается от ваших стандартных данных о вращении.
Чтобы подготовить держатель для чипов, разрежьте два листа полиэфирной фольги примерно на квадраты размером 6 на 6 сантиметров и поместите листы поверх двух опорных пластин. Используя металлические уплотнительные кольца, закрепите листы на месте, затем осторожно потяните за лишнюю фольгу, чтобы удалить любые складки. Затем выберите кремниевый чип с соответствующими размерами отверстий относительно размера анализируемых кристаллов.
Тлеющий разряд чипа в течение 25 секунд при 0,39 миллибар, с током 15 миллиампер. Используйте пинцет, чтобы поместить кремниевый чип на ступень загрузки чипа, с поднятыми стержнями, обращенными вниз. Затем, используя пипетку, нанесите 200 микролитров микрокристаллического суспензии на плоскую сторону чипа, распределив суспензию, чтобы покрыть все городские кварталы чипа.
Если чип поврежден, закройте любые отверстия небольшим кусочком полиэфирной фольги, чтобы обеспечить равномерное применение вакуума. Затем примените мягкий вакуум, чтобы аспирировать всю лишнюю жидкость через чип. Извлеките чип из стадии загрузки чипа и тщательно промойте нижнюю часть чипа фильтровальной бумагой, чтобы удалить лишнюю жидкость.
Поместите загруженный чип на большую половину держателя чипа между направляющими метками, плоской стороной вниз. Поместите маленькую половину держателя чипа на чип, чтобы запечатать его. Две половинки держателя чипа должны защелкнуться на месте.
Затем, используя шестигранные болты, надежно закрепите чип на месте. Чтобы выровнять чип, удерживайте держатель чипа под углом 30 градусов при приближении к креплению. Затем используйте кинематические крепления, чтобы поместить загруженный чип на ступень XYZ на линии луча.
Когда магниты соприкоснутся, позвольте держателю чипа вращаться параллельно потоку и нажмите на место. После того, как чип размещен, используйте систему просмотра линии луча по оси и графический пользовательский интерфейс выравнивания чипа, чтобы найти верхнюю левую фидуциаль чипа. Чтобы сосредоточиться на фидуциальном 0 в X, Y и Z, перемещайтесь внутрь и вне фокуса, чтобы выровнять Z, вверх и вниз, чтобы выровнять Y, а также влево и вправо, чтобы выровнять X.Затем нажмите установить Fiducial 0"После выравнивания фидуциального 1 и 2 с рентгеновским лучом таким же образом нажмите кнопку Создать систему координат", чтобы создать матрицу координат.
Затем нажмите «Проверка блока», чтобы переместить стадию XYZ в первую колодцу каждого городского квартала. Если рентгеновское перекрестие совпадает с диафрагмами, чип выравнивается. В этом графическом представлении результатов поиска пятен с помощью DIALS можно наблюдать график обновления скорости попадания.
При нажатии на удар соответствующее дифракционное изображение будет отображаться в средстве просмотра изображений DIALS. В этой таблице можно визуализировать текущие показатели индексации и интеграции, которые обновляются в режиме реального времени по мере сбора данных во время посещения. Визуализация параметров ячейки блока позволяет выявить полиморфы.
Двумерные графики полезных параметров также могут быть получены для выявления изменений, которые возникают из-за эффектов нагрузки или обезвоживания. Стереографические проекции могут выявить наличие или отсутствие предпочтительных ориентаций, которые могут быть возвращены в протокол загрузки. Например, в этой проекции можно наблюдать эффекты перегрузки чипа кристаллами лизоцима.
При загрузке чипа медленно используйте палец, чтобы положить пипетку над чипом. Это предотвращает прикосновение к чипу и случайное пронзание отверстий в кремнии. При обработке данных используйте доступные автоматизированные конвейеры.
Это даст вам хорошее представление о том, как продвигается ваш эксперимент, и нужно ли вам что-то варьировать. Этот метод может быть применен к любой белковой системе, которая может кристаллизоваться в значительных количествах. И реакция может быть спровоцирована легкими рентгеновскими лучами или быстрым перемешиванием.
Динамические исследования ряда структур могут дать представление о том, как функционируют белки.
Обзор
В данной статье представлено подробное руководство по подготовке образцов на фиксированных мишенях, сбору и обработке данных для серийной синхротронной кристаллографии на станции I24 комплекса Diamond. Особое внимание уделяется методологии проведения экспериментов при ограниченном количестве образца с обеспечением целостности чипа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Кристаллография
- Динамика белков
Теоретическая справка
- Последовательная синхротронная кристаллография (SSX) — это развивающаяся область макромолекулярной кристаллографии.
- Она подходит для экспериментов с низкой дозой облучения и при комнатной температуре.
- SSX позволяет проводить динамические исследования белков, обеспечивая визуализацию их функций.
- Метод SSX с фиксированной мишенью позволяет эффективно использовать ограниченное количество образцов.
Цель исследования
- Представить подробный протокол проведения SSX с фиксированной мишенью на линии I24 установки Diamond.
- Обеспечить правильную подготовку и юстировку чипа для оптимального сбора данных.
- Осветить различия в обработке данных по сравнению со стандартными данными ротации.
Используемые методы
- Подготовка кремниевых чипов с использованием полиэстерной пленки и методов герметизации.
- Нанесение суспензии микрокристаллов на чипы и вакуумная аспирация.
- Юстировка чипа с помощью графического интерфейса пользователя на линии пучка.
- Визуализация и обработка данных в режиме реального времени с использованием автоматизированных конвейеров.
Основные результаты
- Успешное совмещение кристаллов обеспечивает точность сбора данных.
- Мониторинг скорости индексирования и интегрирования в режиме реального времени в ходе экспериментов.
- Визуализация параметров элементарной ячейки позволяет выявить полиморфы и эффекты нагрузки.
- Динамические исследования позволяют получить сведения о функциональности белков.
Выводы
- Данный протокол повышает эффективность экспериментов по SSX с фиксированной мишенью.
- Правильное обращение с чипом и его точное совмещение имеют решающее значение для успешного сбора данных.
- Динамические исследования с использованием SSX могут значительно углубить наше понимание поведения белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Серийная синхротронная кристаллография с фиксированной мишенью позволяет структурным биологам проводить динамические исследования белков при использовании ограниченного количества образцов, что способствует валидации мишеней за счет получения структурных данных высокого разрешения. Этот метод снижает расход образца при сохранении качества данных, что критически важно на ранних этапах поиска, когда экспрессия и очистка белков являются узкими местами. Облегчая проведение экспериментов при комнатной температуре и с временным разрешением, данный подход углубляет понимание механизмов функционирования белков, что помогает в оптимизации ведущих соединений и снижении рисков на этапе доклинических разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем фиксации конформаций белков в действии, что способствует функциональной валидации мишеней.
- Практическая ценность: снижает зависимость от больших объемов кристаллов, позволяя проводить скрининг труднодоступных мишеней с ограниченным выходом экспрессии.
- Прогностическая достоверность: предоставляет структурные данные, которые позволяют охарактеризовать сайт связывания и механизм действия, что улучшает принятие решений по выбору мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные карты электронной плотности микрокристаллов, обеспечивая точную оценку связывания лигандов.
- Операционная ценность: стандартизирует монтаж и юстировку образцов с помощью чиповых систем, что повышает воспроизводимость в ходе кампаний по скринингу.
- Готовность анализа: обеспечивает получение в реальном времени показателей частоты попаданий и метрик индексации, что помогает принимать решения о продолжении или прекращении работы при скрининге фрагментов или соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: выявление полиморфных форм и конформационных изменений, которые могут влиять на связывание или стабильность лекарственного препарата, что позволяет оптимизировать стратегии разработки состава.
- Практическая ценность: получение структурных данных с временным разрешением, которые могут коррелировать с функциональными анализами, что усиливает согласованность трансляционных биомаркеров.
- Снижение рисков: раннее выявление артефактов, вызванных нагрузкой, или эффектов дегидратации, что снижает риск неправильной интерпретации при последующей оптимизации.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Рентгеновская кристаллография с фиксированной мишенью (SSX) интегрируется в рабочий процесс поиска новых лекарственных средств после идентификации мишени и разработки анализа, предоставляя структурную информацию, которая направляет поиск ведущих соединений и доклиническую валидацию. Она поддерживает итерационные циклы «дизайн — синтез — тест — анализ», обеспечивая быструю структурную обратную связь о связывании соединений и динамике белков.
- Поиск новых биологических мишеней: способствует проверке гипотез путем визуализации индуцированных лигандом конформационных изменений и динамики белков, имеющих значение для механизма действия.
- Скрининг: обеспечивает готовность анализа за счет стандартизированной подготовки и выравнивания чипов, гарантируя стабильное качество данных при скрининге соединений.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели, включая параметры элементарной ячейки, частоту обнаружения хитов и метрики интеграции, что позволяет объективно сравнивать экспериментальные условия.
- Трансляционные исследования: связывает структурные наблюдения с функциональными результатами, выявляя динамические процессы, которые могут влиять на биодоступность или связывание с мишенью.
- Корпоративное повторное использование: создает многоразовую платформу для структурного скрининга по нескольким мишеням, сокращая трудозатраты на повторную валидацию в условиях многопроектной среды.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов при валидации мишеней, предоставляя структурные данные высокого разрешения с временным разрешением в условиях, близких к физиологическим.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет стандартизированных методов работы с чипами, протоколов выравнивания и автоматизированных конвейеров обработки данных.
- Стратегическая ценность: повышает эффективность использования капитала, сводя к минимуму расход образцов и обеспечивая возможность быстрой итерации в кампаниях по структурной оптимизации.
- Влияние на портфель: поддерживает принятие обоснованных решений по продвижению проектов с учетом рисков, снижая механистическую неопределенность в понимании взаимодействий между мишенью и лигандом.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области макромолекулярной кристаллографии и знакомство с методами подготовки образцов на синхротронах.
- Необходим доступ к инфраструктуре линии излучения с кинематическим креплением, системой осевого обзора и автоматизированными конвейерами обработки данных, такими как DIALS.
- Требуется межкомандная стандартизация процедур подготовки чипов, вакуумного аспирирования и юстировки для обеспечения согласованности данных.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных размеров кристаллов и пространственных групп, что требует корректировки выбора апертуры и методов распределения.
- Существуют практические ограничения, такие как хрупкость чипа при загрузке и очистке, а также чувствительность к эффектам дегидратации, которые могут со временем повлиять на качество кристаллов.
