Генерация и расширение кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента
12 февраля 2021 г.
Здесь мы представляем протокол для надежной генерации и расширения кардиомиоцитов человека из мононуклеарных клеток периферической крови пациента.
Это комплексные протокольные средства, генерация сырых импульсов и использование специфических для пациента культур из мононуклеарных клеток периферической крови. Эта тактика воспроизводима и проста в использовании, особенно для начинающих. И не требуют, специальной экспертизы в балладах о стволовых клетках или сердечно-сосудистой медицине.
Наш протокол может быть использован для генерации специфических для пациента кардиомиоцитов из одного забора крови, которые могут быть использованы для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний и тестирования сердечной токсичности новых лекарств. Этот протокол требует длительной приверженности поддержанию перепрограммирования стволовых клеток и направленной дифференцировке. Тем не менее, вы действительно цените свои усилия.
Когда вы видите бьющиеся кардиомиоциты в блюде. Когда человеческие колонии iPSC достигают более 90% конфлюентности, промывайте каждую лунку тремя миллилитрами DPBS перед обработкой клеток одним миллилитром 0,5 миллимолярной ЭДТА в DPBS на лунку при 37 градусах Цельсия. Через пять-восемь минут добавьте по одному миллилитру проходной среды iPSC в каждую лунку и вручную вытесните ячейки.
Перенос от 600 до 900 микролитров клеток в отдельные Уэллсы имеют базальную мембрану, покрытую шестью пластинами скважины для ночной инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа. Затем обновляйте культуры двумя миллилитрами полной среды E8 каждый день в течение трех-четырех дней. Когда культура достигнет слияния, замените среду двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов, по два на лунку.
На второй день замените супернатанты двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов. На третий день замените супернатанты двумя миллилитрами тридифференцировочной среды кардиомиоцитов. На пятый день.
Замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов один. С седьмого по 10-й день замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов четыре. На 11 и 13 день.
При сокращении клеток заменяют супернатант двумя миллилитрами кардиомиоциферировочной среды пять. В 15, 17, 19 и 21 дни. Замените супернатант двумя миллилитрами среды дифференцировки кардиомиоцитов четыре.
После предварительной культивации с полной средой крови в течение семи дней ПБМК становятся большими с видимыми ядрами и цитоплазмой, что указывает на то, что они готовы к трансфекции с факторами перепрограммирования вируса Сендай. После введения в полную среду E8. Полностью перепрограммированные клетки прикрепятся и начнут образовывать колонии.
После четырех-пяти проходов из перепрограммированных клеток образуются высокочистые колонии iPSC с очень небольшим количеством дифференцированных клеток. На этом этапе большинство клеток являются OCT4 и NANOG положительными, что свидетельствует об их плюрипотении. Биение кардиомиоцитов обычно наблюдается после 12 дней дифференцировки.
После глюкозного голодания и повторного покрытия iPSC кардиомиоциты проявляют спонтанное биение и выровненную саркомерную структуру с интеркалированным сердечным тропонином Т и экспрессией альфа-актинина. Колонии сохраняют свою чистоту, о чем свидетельствует их выражение тропонина Т. Хотя iPSC кардиомиоциты относительно незрелые по сравнению со взрослыми кардиомиоцитами.
Они демонстрируют желудочковые и предсердные потенциалы действия, измеряемые оптовым пластырем, зажимом. Желудочковые кардиомиоциты экспрессируют миозин легкой цепью два, тогда как предсердные iPSC кардиомиоциты отмечены экспрессией NR2F2. Активация Wnt стимулирует деление клеток и способствует экспрессии регуляторов клеточного цикла.
Интересно, что активация Wnt также индуцирует устойчивую пролиферацию ранних кардиомиоцитов iPSC в течение двух проходов по сравнению с контрольной группой, хотя эта пролиферативная способность со временем уменьшается. Убедитесь, что PBMS увеличены с помощью прозрачной ядерной и цитоплазмы, прежде чем будут введены векторы перепрограммирования iPSC, поскольку состояние PBM имеет решающее значение для перепрограммирования iPSC. Кардиомиоциты, специфичные для пациента, ценны для моделирования сердечно-сосудистых заболеваний in vitro и для обеспечения тонны донорских клеток для терапии стволовыми клетками сердца.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол позволяет генерировать и экспансировать специфичные для пациента кардиомиоциты из мононуклеарных клеток периферической крови. Он разработан таким образом, чтобы быть воспроизводимым и доступным для исследователей, особенно для начинающих.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Сердечно-сосудистая медицина
- Биология стволовых клеток
Теоретические сведения
- Кардиомиоциты имеют решающее значение для изучения сердечных заболеваний.
- Клетки конкретного пациента могут улучшить моделирование заболеваний.
- Мононуклеарные клетки периферической крови являются неинвазивным источником.
- Перепрограммирование стволовых клеток требует тщательного поддержания условий культивирования.
Цель исследования
- Разработать протокол получения кардиомиоцитов из образцов крови.
- Обеспечить возможность моделирования сердечно-сосудистых заболеваний.
- Проверять кардиотоксичность новых лекарственных препаратов.
Используемые методы
- Сбор мононуклеарных клеток периферической крови.
- Методы репрограммирования стволовых клеток.
- Направленная дифференцировка в кардиомиоциты.
- Протоколы длительного культивирования.
Основные результаты
- Успешное получение пациент-специфических кардиомиоцитов.
- Воспроизводимость протокола для различных образцов.
- Доступность метода для начинающих специалистов без обширного опыта.
- Потенциальные возможности применения в тестировании лекарственных препаратов и моделировании заболеваний.
Выводы
- Данный протокол предлагает практический подход для исследователей.
- Он способствует развитию сердечно-сосудистых исследований.
- Будущие исследования могут быть основаны на данной методологии.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Получение специфичных для пациента кардиомиоцитов из мононуклеарных клеток периферической крови обеспечивает масштабируемое и воспроизводимое моделирование заболеваний и тестирование кардиотоксичности. Данный подход способствует валидации мишеней на ранних этапах и идентификации перспективных соединений за счет предоставления клеточных систем, релевантных для человека. Это снижает зависимость от животных моделей и повышает прогностическую достоверность доклинических сердечно-сосудистых исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием кардиомиоцитов, полученных от пациентов, которые отражают генетический фон заболевания.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков за счет функциональной оценки сократимости и электрофизиологических свойств.
- Прогностическая ценность: облегчает уточнение сигнальных путей и механическое снижение рисков для сердечно-сосудистых мишеней до этапа оптимизации ведущих соединений.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать масштабируемые популяции сокращающихся кардиомиоцитов, пригодных для функционального анализа с высоким содержанием данных.
- Практическая ценность: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели, включая кальциевые транзиенты и продолжительность потенциала поля, для скрининга соединений.
- Готовность анализа: позволяет создавать стандартизированные платформы на основе монослоя, совместимые с автоматизированными системами визуализации и электрофизиологии.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Моделирует фенотипы кардиомиоцитов желудочков и предсердий человека для изучения механизмов развития заболеваний.
- Практическая ценность: Обеспечивает возможность пролонгированного расширения популяции с использованием CHIR99021 для получения количества клеток, достаточного для исследований, необходимых для подачи заявки на регистрацию нового лекарственного препарата (IND).
- Трансляционная преемственность: Связывает этап открытия с доклинической валидацией посредством использования стабильных, специфичных для конкретного пациента клеточных систем.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий цикл разработки лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации соединений-лидеров до оценки доклинической безопасности.
- Открывающая биология: позволяет проверять гипотезы путем направленной дифференцировки иПСК в функционально зрелые подтипы кардиомиоцитов.
- Скрининг: предоставляет электрофизиологически активные кардиомиоциты, готовые к проведению анализов для профилирования ионных каналов и сократимости.
- Аналитика: обеспечивает получение данных о потенциалах действия и регуляции кальция для сравнительного анализа соединений.
- Трансляционные исследования: сохраняют фенотипическую релевантность на всех этапах: от получения иПСК до их экспансии и характеристики.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает масштабируемый неинвазивный рабочий процесс получения клеток, применимый в нескольких кардиологических программах.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает достоверность валидации мишеней за счет использования генетически сопоставимых клеточных моделей, релевантных для человека.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость и стандартизацию с помощью четко определенных протоколов дифференцировки и экспансии с использованием малых молекул.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет раннего выявления рисков кардиотоксичности.
- Влияние на портфель: Способствует продвижению проектов с учетом рисков за счет снижения частоты неудач при трансляции в исследованиях сердечно-сосудистых заболеваний.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами стволовых клеток, репрограммированием в иПСК и кардиальной дифференцировкой.
- Зависимость от использования определенных сред, малых молекул (CHIR99021) и платформ с покрытием из внеклеточного матрикса.
- Необходимость соблюдения стандартизированных операционных процедур при пассировании, определении сроков дифференцировки и контроле качества.
- Требуется мониторинг адаптации при масштабировании процесса для различных линий иПСК, полученных от пациентов.
- Ограничено относительной незрелостью кардиомиоцитов, полученных из иПСК, по сравнению с их взрослыми человеческими аналогами.
