Мультиплексированный анализ экспрессии генов сетчатки и доступности хроматина с использованием scRNA-Seq и scATAC-Seq

Этот протокол позволит использовать одноклеточную РНК-seq для начального фенотипирования. И, в паре с одноклеточным ATAC-seq, реконструкция генных регуляторных сетей. Использование MULTI-seq снижает затраты на первоначальное исследование, а фиксация парных образцов для одноклеточных RNA-seq и одноклеточных ATAC-seq позволяет проводить анализ регуляторных сетей генов.

Исследователи могут использовать этот протокол для понимания генетических сетей, контролирующих развитие и прогрессирование заболевания. Для начала добавьте 20 микролитров якорного раствора штрих-кода к каждому образцу и перемешайте его. Высиживать его на льду в течение пяти минут.

Затем добавьте 20 микролитров раствора ко-анкера к каждому образцу и высиживайте на льду еще пять минут. Добавьте один миллилитр ледяного холода 1% BSA и PBS к каждому образцу и центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Удалите супернатант, не нарушая гранулу клетки.

Затем добавьте 400 микролитров ледяного холода 1% BSA и PBS. Центрифуга при 300 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. Определите концентрацию клеток для каждого образца с помощью гемоцитометра и рассчитайте общее количество клеток и объем, необходимые для Gel Bead-in-Emulsion или GEM.

Объедините рассчитанные объемы из каждого образца в новой стерильной 1,5-миллилитровой пробирке и определите конечную концентрацию клеток комбинированных образцов. После генерации GEM и штрих-кодирования выполните очистку кДНК экспрессии генов с помощью выбора размера, следя за тем, чтобы не выбрасывать супернатант из первого раунда отбора, который содержит образец штрих-кода. Перенесите супернатант в новую стерильную микроцентрифужную трубку размером 1,5 миллилитра и храните на льду.

Вихрь реагента для подбора размера на основе парамагнитных шариков и добавьте 260 микролитров реагента и 180 микролитров 100% изопропанола к супернатанту. Пипетку перемешивают 10 раз и инкубируют при комнатной температуре в течение пяти минут. Поместите трубку на магнитную стойку и дождитесь очистки раствора.

Как только раствор будет очищен, удалите и выбросьте супернатант. Добавьте 500 микролитров 80% этанола в шарики в течение 30 секунд, затем выбросьте супернатант. Повторите это в общей сложности две стирки.

Кратковременно центрифугируйте бусины и верните их в магнитную стойку. Установите для таймера значение две минуты. Затем удалите остаточный этанол пипеткой P10 и высушите шарики на воздухе на магнитной стойке в течение оставшихся двух минут.

Извлеките шарики из магнитной стойки и повторно суспендируйте их в 100 микролитрах элюционного буфера. Пипетку тщательно повторно суспендировать, и инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут, затем вернуть бусины в магнитную стойку и дождаться очистки раствора. Перенесите супернатант в свежую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 миллилитра.

Повторите очистку, как показано на рисунке, используя половину объема буфера элюирования. Для образцов, предназначенных для последовательности scATAC, удалите любую жидкость из микроцентрифужной трубки с помощью пипетки P200 и заморозьте образцы во флэш-памяти в этаноловом сухом льду. Чтобы диссоциировать клетки в образцах, предназначенных для секвенирования скРНК, выполните шаги диссоциации с использованием папаина, как описано в текстовой рукописи.

Центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение трех минут при комнатной температуре и удалите супернатант, не нарушая гранулу клетки. Добавьте один миллилитр охлажденного PBS и перемешайте 10 раз или до тех пор, пока клетки полностью не станут взвешенными. Опять же, центрифугу при 300 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и повторите стирку pBS дважды.

Начните вихрять трубку на самой низкой скорости и добавьте 900 микролитров охлажденного метанола, каплю за каплей, продолжая осторожно вихрять трубку, чтобы предотвратить слипание клеток. Инкубируйте клетки на льду в течение 15 минут. Определите концентрацию фиксированных клеток с помощью гемоцитометра, а также оцените эффективность стадии фиксации с помощью трипан-синего цвета.

Храните замороженные ткани и фиксированные клетки при минус 80 градусах Цельсия. Многопоследовательное штрихкодирование обеспечивает комбинированное секвенирование нескольких образцов и их последующую вычислительную деконволюцию. Образец происхождения может быть определен для каждой ячейки на основе их экспрессии штрих-кода.

Эти комбинированные образцы могут быть проанализированы как единый набор данных для целей кластеризации клеток и идентификации типа клеток. Поскольку каждая ячейка штрих-кодируется до генерации GEM, дублеты клеток будут иметь высокую вероятность демонстрации экспрессии для нескольких штрих-кодов последовательности MULTI, и поэтому большинство дублетов могут быть идентифицированы и удалены до кластеризации и идентификации типа ячейки. Секвенирование ATAC с одной клеткой может быть использовано для создания набора данных с типами клеток, чтобы соответствовать тем, которые были обнаружены путем секвенирования одноклеточной РНК.

Сопряжение информации о доступности ДНК для секвенирования одноклеточной РНК и информации о доступности ДНК для секвенирования одноклеточной ATAC позволяет реконструировать генные регуляторные сети. При попытке протокола имейте в виду, что двухминутное время испарения этнола имеет решающее значение для извлечения последовательности на последующих этапах элюирования. Реконструкция регуляторных сетей генов с использованием парных одноклеточных РНК-seq и одноклеточных ATAC-seq производит мишени для исследований гиперэкспрессии генов и нокаута.

MULTI-seq может быть использован на этом этапе для идентификации специфических эффектов типа клеток.