Многовременные методы микроскопии для характеристики флуоресцентно меченых микропузырьков для ультразвукового высвобождения лекарственных средств

Этот протокол может быть использован для характеристики реакции флуоресцентно меченых микропузырьков, которые предназначены для ультразвуковых приложений доставки лекарств, которые включают механизмы активации и биоэффекты. Ключ заключается в сочетании методов визуализации, которые позволяют нам разгадать многомасштабную проблему ультразвуковой доставки лекарств с пузырьками, как в разных пространственных масштабах, так и в разных временных масштабах. Для однопузырьковой визуализации с помощью микроскопии Brightfield поместите вентиляционную иглу 19 калибра и используйте один миллилитровый шприц, оснащенный иглой 19 калибра, чтобы удалить небольшое количество микропузырчатой суспензии из стеклянного флакона в небольшую трубку для облегчения пипетки на следующем этапе.

Используя пипетку, разбавьте микропузырьковый раствор в фильтрованном фосфатном буферном физиологическом растворе. Используйте 10-миллилитровый шприц для введения образца в одно выходное отверстие держателя образца до тех пор, пока держатель не заполнится без создания пузырьков воздуха, впрыскивая больше образца, если это необходимо. Закройте оба клапана держателя образца и поместите держатель образца перпендикулярно оптической оси микроскопа.

Перед анализом образца установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и, начиная с поля зрения в одном углу держателя образца, используйте ступень XYZ для перемещения держателя, чтобы найти отдельные микропузырьки в поле зрения микроскопа, затем присоедините оптическое волокно, подключенное к водяной бане, к стробоскопическому свету и начните запись. Повторите визуализацию столько раз, сколько необходимо для каждой настройки ультразвука, перемещая держатель образца по крайней мере на два миллиметра в поле зрения, содержащее микропузырьки без звука для каждого анализа. Для флуоресцентной микроскопической визуализации микропузырьков, после разбавления микропузырька в фосфатно-буферном физиологическом растворе, как показано, установите желаемую частоту ультразвукового привода и акустическое давление на генератор сигналов произвольной формы и установите триггерную задержку для лазера на генераторе задержки импульсов для флуоресцентного возбуждения наночастиц из микропузырьков, затем используйте стадию XYZ для перемещения держателя образца для обнаружения одиночных микропузырьков и приведения их в фокус цель, затем запустите запись.

Повторите визуализацию по своему усмотрению, изменив настройки ультразвука и переместив держатель образца в новое поле зрения, как показано на рисунке. Для визуализации с помощью прижизненной микроскопии сначала поместите нагретый держатель животного на ступень позиционирования XY между волноводом и объективом и добавьте соединительный гель к волноводу. Вставьте катетер хвостовой вены в хвостовую вену анестезируемой опухоленосной мыши и поместите мышь, оснащенную оконной камерой, в нагретый держатель.

Добавьте каплю воды в крышку. Чтобы визуализировать сосудистую ткань опухоли, внутривенно вводят 30 микролитров по четыре миллиграмма на миллилитр флуоресцентно меченого 2 мегадальтонного декстрана в катетер хвостовой вены и используют стадию трансляции XY для перемещения мыши до тех пор, пока не будет найдено поле зрения с подходящими кровеносными сосудами. Отрегулируйте частоту кадров, поле зрения и длину записи в соответствии с параметрами эксперимента и запишите базовые изображения сосудов.

После получения исходных изображений установите частоту ультразвукового привода, длину импульса и амплитуду акустического давления на генераторе сигналов произвольной формы и внутривенно введите 50 микролитров микропузырькового образца в хвостовую вену. Затем изобразите сосудистую систему, как показано. Анализ микропузырьков конфокальной флуоресцентной микроскопией выявляет неравномерное распределение частиц микропузырьковой оболочки.

Общая структура микропузырьков может быть дополнительно визуализирована с помощью сканирующей электронной микроскопии. Анализ радиальной динамики и феноменологического поведения инсонифицированного микропузырька методом микроскопии Брайтфилда позволяет оценить относительное изменение радиуса микропузырька с течением времени. Здесь показана последовательность изображений типичной успешной доставки флуоресцентно меченых наночастиц.

Можно наблюдать, как наночастицы, встроенные в микропузырьковую оболочку, флуоресцируют, когда лазерный свет достигает пузыря. Однако, как наблюдалось в этой неудачной доставке, флуоресцентные наночастицы светятся на оболочке микропузырька, которая остается неповрежденной во время ультразвукового воздействия. Прижизненная многофотонная визуализация может быть использована для определения пространственной и временной экстравазации наночастиц во время ультразвукового воздействия, что может быть полезно для понимания и оптимизации механизмов, лежащих в основе доставки наночастиц, опосредованных ультразвуком.

Благодаря идеальному выравниванию оптических и акустических путей на всех протяженностях и во всех временных масштабах обеспечивается всестороннее понимание доставки лекарств, вызванных ультразвуком. Ответы, полученные в результате наших многомасштабных экспериментов, теперь будут переведены в клиническую практику. Результаты предоставят ценную информацию для целого ряда терапевтических применений, включая терапию рака.