Скрининг фрагментов на основе ЯМР в режиме минимальной выборки, но максимальной автоматизации

Мы проводим исследования ядерного магнитного резонанса. Это позволяет определить структуры белков, РНК и ДНК в растворе. Эти биомолекулы являются составляющими, являются компонентами наших клеток, и наши протоколы, которые мы представляем здесь, связаны с скринингом малых молекул и их связыванием с этими мишенями.

Из этих молекул наша медицинская химия и структурная биология могут получить новые лекарства, которые борются с болезнями. Основное преимущество нашей методики заключается в том, что мы имеем полный контроль над качеством молекулярных мишеней, таких как белки, и мы имеем полный контроль над качеством фрагментов малых молекул и лекарств, а также мы можем проводить скрининг белков на связывание широкого спектра сродств, что является преимуществом по сравнению с другими методологиями. Чтобы подготовить образцы экрана для измерения ЯМР, используйте робота-пробоподготовки для распределения 768 соединений по восьми 96-луночным планшетам, чтобы получить 64 смеси, содержащие 12 фрагментов, до конечной концентрации 4,2 миллимоляра на смесь.

Перенесите интересующую биомолекулярную мишень, разбавленную в соответствующем просеивающем буфере, в соответствующее количество трехмиллиметровых высокопроизводительных пробирок для смены образцов ЯМР со штрих-кодом и используйте робота для переноса 10 микролитров каждой смеси лигандов в каждую пробирку с целевой биомолекулой. Затем попросите робота тщательно перемешать растворы. Для сбора данных ЯМР загрузите образец в спектрометр.

Откройте программное обеспечение спектрометра, затем выберите набор параметров и последовательности импульсов для экспериментов на основе лигандов. Для всех перечисленных экспериментов в качестве подавления воды выберите коррекцию возбуждения. Для скрининга фтора-19 выберите эксперименты 1D и T2.

Выберите спектральную ширину до 220 частей на миллион, частоту возбуждения до 140 частей на миллион и время анализа от одного до пяти часов. Для T2 время CPMG должно чередоваться от 5 до 100 миллисекунд. Запишите эксперименты T1r и T2.

Запишите разницу переноса насыщения в виде псевдо-2D. Для обработки двух одиночных 1D-спектров используйте функцию ProcStd программы AU с опцией релаксации или без нее. WaterLOGSY представляет собой одиночный 1D, который должен быть фазирован отрицательным для сигнала растворителя.

Чтобы проанализировать данные скрининга водорода, следуйте инструкциям к инструменту скрининга на основе фрагментов, чтобы сохранить данные биомолекулярного магнитно-резонансного ЯМР из скрининговых кампаний, так что каждая просеивающая смесь имеет свой каталог, в котором подкаталог содержит различные эксперименты, измеренные на образце. Храните эталонные спектры, сохраняя все данные из образцов без биомолекулярной мишени, но со смесями и единичным соединением в разных каталогах. Создайте прямой путь к каталогу, содержащему полученные данные, и выберите каталог ЯМР, в котором все смеси должны иметь отдельный каталог.

Убедитесь, что CSV-файл, фрагмент экрана, XML-документ и файлы BAC также скопированы в каталог NMR данных. Чтобы использовать инструмент скрининга на основе фрагментов для распространённого образца, перетащите символ проекта растрирования на основе фрагментов в середину окна анализа. Символ должен появиться, если в него были скопированы ранее сохраненные наборы данных.

Должно автоматически открыться окно параметров экранирования на основе фрагментов. Выберите CSV-файл коктейля, содержащий названия смесей, названия каждого фрагмента и разделение каждого фрагмента на миксы. Определите папку спектров эталонных лигандов со всеми измеренными спектрами отдельных фрагментов и определите папку эталонных пустых экспериментов, которая обычно содержит наборы данных смесей без исследуемой мишени.

Чтобы определить исследуемые спектры и цвета отображения спектров, откройте вкладку «Типы спектров» и установите тип спецификации в соответствии с данными процесса. На вкладке «Макет дисплея» определите спектры, которые будут сравниваться в соответствии с типами спецификаций. Затем нажмите кнопку ОК, чтобы запустить проект.

Пока данные обрабатываются, откроется отдельное окно с таблицей, в которой будут обобщены все коктейльные смеси и лиганды каждой смеси. Дважды щелкните ячейку, чтобы открыть соответствующие наборы данных. Перед назначением связующих убедитесь, что контрольные пики совпадают друг с другом и имеют одинаковый химический сдвиг.

Если наблюдаются различия, откройте вкладку «Процесс» и используйте параметр последовательной обработки, чтобы исправить их. Для первого анализа смесей фтора-19 откройте вкладку «Анализ» и выберите функцию интеграции. Убедитесь, что для каждого фрагмента в смеси определена четкая область интеграции для соответствующего сигнала фтора-19.

Сохраните экспортируемые регионы интеграции, чтобы экспортировать файл интеграции для дальнейшего использования, и сохраните все использованные файлы интеграции в соответствующем каталоге установки. Для данных по фтору-19 откройте набор данных с исследуемым целевым объектом или без него, а затем на вкладке "Анализ" щелкните "Интегрировать и прочитать регионы интеграции импорта", чтобы загрузить соответствующий файл интеграции в текущий спектр. Затем нажмите кнопку «Сохранить и вернуться», чтобы найти список интегрированных областей на вкладке «Интегралы», и скопируйте эту информацию в электронную таблицу для последующего анализа.

Молекулярная структура или строение лигандов в библиотеке фрагментов анализируется с использованием программного обеспечения молекулярной достоверности, как показано, и результаты представляются в виде графического вывода. Оранжевый цвет указывает на то, что фрагмент демонстрирует несоответствие по структуре или концентрации. Лунки зеленого цвета указывают на то, что фрагмент является последовательным.

В этом репрезентативном анализе 103 фрагмента, содержащих одну или несколько фторсодержащих групп из собственной библиотеки, были разделены на пять смесей по 20-21 фрагменту в смеси. Эксперименты по поперечной релаксации фтора-19 были измерены для каждой смеси, в которой применялись последовательности импульсов CPMG. Пороговые значения полезны для определения связующего, слабого связывающего или несвязывающего вещества в смеси, как это наблюдается в этих типичных спектрах тиаминпротеиновой тирозинкиназы А и РНК.

В этом репрезентативном анализе первый удар показал снижение T2 примерно на 50% и химический сдвиг, превышающий или равный шести герцам. WaterLOGSY не показал значительных изменений в сигнале, который можно было бы считать положительным. Однако, поскольку два из трех экспериментов были положительными, этот фрагмент был засчитан как попадание.

Для второго удара T2 показал снижение интенсивности сигнала примерно на 80%. Явное изменение сигнала также наблюдалось для WaterLOGSY. Химического сдвига было недостаточно в этом эксперименте, но, поскольку два предыдущих критерия были положительными, он все равно считался хитом.

Конечная цель таких методов состоит в том, чтобы разработать новые лекарства или высокоаффинные ингибиторы, например, ферментов, и в этом случае медицинская химия берет на себя и синтезирует эти новые молекулы, но структурная биология, методы, которые вы применяете здесь, могут направлять медицинскую химию и сделать этот подход намного быстрее.