Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия динамики кальция в острых срезах ткани поджелудочной железы мыши

В сочетании с визуализацией кальция живыми клетками метод острого среза ткани поджелудочной железы позволяет изучать межклеточные волны и многоклеточную функциональную связь с высоким разрешением в течение длительных периодов времени. Основными преимуществами этой методики является то, что она быстрая, сохраняет тканевую архитектуру и уменьшает ограниченное ферментативное и механическое напряжение при сохранении высокого выхода ткани. Обнаруживая функциональные и морфологические изменения во время прогрессирования заболевания, этот метод помогает нам понять заболевания, связанные с поджелудочной железой, такие как диабет.

Этот метод среза ткани может быть применен к тканям мозга, гипофиза и надпочечников с акцентом на сохранение межклеточного контакта, паракринных взаимодействий и тканевой архитектуры. Чтобы подготовиться к инъекции агарозы в поджелудочную железу мыши, заполните пятимиллилитровой шприц жидкой агарозой 40 градусов Цельсия и оснастите шприц иглой 30 калибра. После тщательного покрытия иглы колпачком поместите конец иглы шприца вниз, со всем объемом агарозы ниже поверхности воды, на водяную баню с температурой 40 градусов Цельсия.

Пузырьк с внеклеточным раствором с карбогеном, непрерывно на льду, со скоростью 1,5 миллилитра в минуту при барометрическом давлении и комнатной температуре, чтобы обеспечить оксигенацию и рН 7,4. Для выполнения инъекции агарозы поместите усыпленную взрослую мышь под стереомикроскоп и получите доступ к брюшной полости мыши через лапаротомию. Осторожно переместите кишечник в левую сторону, чтобы обнажить общий желчный проток, и используйте щипцы, чтобы слегка приподнять дуоденальный конец протока, чтобы найти сосочек Фатера.

Используйте гемостат для зажима желчного протока в дуоденальном сосочке, чтобы предотвратить утечку агарозы из протока в двенадцатиперстную кишку, и используйте небольшие острые щипцы, чтобы добраться под общим желчным протоком, чтобы разорвать мембрану, которая прикрепляет проток к ткани поджелудочной железы. После очистки протока от как можно большего количества жира и соединительной ткани поместите проток перпендикулярно на кончики пары более крупных щипцов и, крепко надавливая на шприцевой поршень, вводят вязкую жидкую агарозу в проксимальный конец общего желчного протока в течение 20-30 секунд. Когда ткань станет беловатой и слегка растянутой, снимите шприц и медленно вылейте 20 миллилитров пузырькового ледяного внеклеточного раствора на поджелудочную железу, чтобы охладить ткань и затвердеть агарозу.

Для приобретения срезов ткани поджелудочной железы используют щипцы и тонкие жесткие ножницы, чтобы аккуратно перенести введенную агарозу поджелудочной железы в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 40 миллилитров ледяного внеклеточного раствора. Закрутите блюдо, чтобы промыть ткани и перенести поджелудочную железу во вторую посуду из ледяного внеклеточного раствора. Используйте щипцы и ножницы, чтобы разрезать беловатый, хорошо введенный участок поджелудочной железы на шесть кусочков от 0,1 до 0,2 кубического сантиметра и удалить оставшуюся соединительную и жировую ткань из кусочков ткани.

Поместите очищенные блоки в 35-миллиметровую нелипкую нижнюю чашку Петри, содержащую примерно пять миллилитров жидкой агарозы 40 градусов Цельсия, и немедленно поместите чашку Петри на лед. Когда агароза затвердеет, держите чашку Петри вверх ногами над крышкой 100-миллиметровой чашки Петри и используйте половину лезвия бритвы, чтобы аккуратно разрезать край между боковой стенкой чашки Петри и агарозой, чтобы удалить агарозу из чашки. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать отдельные кубики, каждый из которых содержит один тканевый блок агарозы, из освобожденной агарозы и используйте цианоакрилатный клей для прикрепления блоков к пластине образца вибратома.

Заполните режущую камеру вибратома 150 миллилитрами ледяного внеклеточного раствора, непрерывно пузырящегося карбогеном. Прикрутите пластину образца на вибратоме и установите новое лезвие бритвы. Окружите камеру льдом и добавьте два кубика льда объемом 10 миллилитров, приготовленных внеклеточным раствором, дополненным шестью миллимолярами глюкозы.

Установите слайсер на 0,05-1 миллиметр в секунду и 70 герц, затем начните нарезку, чтобы получить кусочки агарозы толщиной 140 микрон с площадью поверхности от 20 до 100 квадратных миллиметров. Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно перенести каждый кусочек в 100-миллиметровую чашку Петри, заполненную 40-миллиметровым буфером HEPES, дополненным шестью миллимолярами глюкозы. Для приготовления кальциевого красителя растворите 50 мкг клеточного проницаемого кальциевого индикаторного красителя, 7,5 микролитра ДМСО и 2,5 микролитра полоксамера и 6,667 миллилитров HBS в 15-миллилитровой шнековой колпачковой трубке.

Используйте пипетку, чтобы тщательно перемешать раствор в течение 20 секунд, прежде чем погрузить трубку в ультразвуковую камеру ванны и вихрь, каждый в течение 30 секунд. Затем аликвота 3,333 миллилитров полученного раствора кальциевого индикаторного красителя в одну чашку Петри объемом 5 миллилитров на 10 ломтиков ткани, подлежащих маркировке. Для загрузки красителем используйте тонкую мягкую кисть, чтобы перенести до 10 ломтиков ткани в каждое блюдо с раствором красителя и поместить посуду на орбитальный шейкер на 50 минут при комнатной температуре и 40 оборотов в минуту, защищенных от света.

В конце инкубации переложите до 20 окрашенных ломтиков в отдельные 60-миллилитровые чашки Петри, наполненные HBS без красителя. Для визуализации кальция с помощью конфокальной микроскопии выберите 20 или 25-кратное увеличение и установите режим сбора на покадровую визуализацию, точечное отверстие от 100 до 200 микрон, а также возбуждение и излучение для флуорофора, используемого в эксперименте. Установите камеру записи и перфузионную систему на ступень микроскопа с контролируемой температурой и расположите входное и выходное отверстие на дальних краях записывающей камеры.

Установите скорость притока и оттока на один-два миллилитра в минуту. Установите температуру обильной системы на 37 градусов цельсия и инициируйте обилие с помощью нестимулирующего раствора. Для записи кальциевой динамики ткани поместите один срез ткани в записывающую камеру и обездвижите ткань U-образной платиновой массой с подтянутой нейлоновой сеткой.

Используйте опцию яркого поля, чтобы найти интересующую структуру и использовать живую визуализацию для позиционирования исследуемых структур в поле зрения. Чтобы оптимизировать отношение сигнал/шум, отрегулируйте мощность лазера, усиление детектора и усреднение линии, сохраняя при этом минимальную мощность лазера. Отрегулируйте фокальную плоскость до 15 микрон ниже поверхности разреза, чтобы избежать записи из потенциально поврежденных клеток и получения изображений.

Установка частоты дискретизации от одного до двух герц для первоначального обнаружения отдельных колебаний и записи изображения с высоким разрешением. Если доступно, используйте онлайн-диаграмму, чтобы получить мгновенную обратную связь о реакции подготовки, переосвещении, фотоотбеливании и механическом дрейфе. Когда все изображения будут получены, сохраните данные для последующего анализа.

Здесь можно наблюдать пример оптимального среза ткани, при котором клеточный проницаемый кальциевый индикаторный краситель был успешно загружен в срез ткани поджелудочной железы. Напротив, эти срезы тканей не являются оптимальными для визуализации из-за неудачного проникновения красителя, отсутствия островковых клеток или обилия некротической ткани на поверхности образцов. Изображения с высоким разрешением среза ткани поджелудочной железы могут быть использованы для очерчивания отдельных областей ткани поджелудочной железы, таких как островки Лангерганса, ацинарная ткань или проток поджелудочной железы.

Стимулы могут быть использованы для функциональной дифференциации между различными островковыми клетками или между островковыми и неостровными клетками. Например, бета-клетки обычно реагируют на квадратную импульсную стимуляцию глюкозой, демонстрируя преходящее увеличение внутриклеточного кальция с последующим быстрым колебанием кальция на устойчивом плато. Напротив, небета-клетки реагируют более быстрыми и нерегулярными колебаниями.

Также может быть измерена задержка начала внутриклеточного увеличения кальция после стимуляции, а также гетерогенность и задержки среди отдельных клеток. Эти же параметры могут быть использованы для описания фазы деактивации. Здесь можно наблюдать схематическое представление продолжительности внутриклеточного колебания кальция, частоты и процента активного времени.

При визуализации со скоростью захвата более 10 герц волны кальция, которые многократно распространяются по островку, могут быть четко распознаны. Зажмите общий желчный проток как можно ближе к двенадцатиперстной кишке, чтобы предотвратить случайное закупорку ветви, которая попадает в поджелудочную железу. Кроме того, не прекращайте нажимать на поршень во время инъекции, потому что агароза сразу затвердеет в игле.

Метод острого среза ткани поджелудочной железы мыши также может быть использован с методом зажима пластыря для изучения токов ионных каналов и цитоза доступа, а также иммуногистохимических исследований и исследований секретаря.