Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

Эти протоколы могут быть использованы для разработки собственных мультиплексных анализов ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Это полезно для людей, которые хотят разработать собственные наборы для обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов. По сравнению с золотым стандартом ОТ-кПЦР, ОТ-дПЦР можно использовать для количественной оценки нескольких генов SARS-CoV-2 без необходимости стандартной кривой.

Поскольку ddPCR является новым методом, визуальная демонстрация важна для того, чтобы помочь нынешним и будущим пользователям понять и легко разработать мультиплексные анализы для обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов. Для синтеза кДНК добавьте два микролитра 5-кратной смеси обратной транскрипции, пять микролитров интересующего образца РНК и три микролитра двойной дистиллированной воды без РНКазы в пробирку для ПЦР объемом 100 или 200 микролитров до конечного объема 10 микролитров в виде раствора и поместите пробирку на лед. Когда реагенты будут добавлены, загрузите образец в термоциклер и настройте прибор на обратную транскрипцию при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, тепловую инактивацию обратной транскрипции в течение 5 секунд при 85 градусах Цельсия и окончательное бесконечное удержание при четырех градусах Цельсия.

Перед проведением капельной цифровой ПЦР добавьте 19,8 микролитра свежеприготовленной мастер-смеси в соответствующее количество лунок 96-луночной планшета для цифровой ПЦР-диагностики без нуклеаз. Добавьте 2,2 микролитра кДНК в каждую лунку мастер-смеси до конечного объема 22 микролитра реакционной смеси на лунку и запечатайте пластину одноразовым запайщиком пластин для ПЦР. Затем встряхните пластину в течение 15-30 секунд в центрифуге в течение 10-15 секунд, чтобы собрать содержимое лунки на дне пластины.

Для автоматической генерации капель на сенсорном экране автоматического генератора капель нажмите «Настроить пластину для образцов» и выберите столбцы, в которых образцы расположены на пластине для образцов. Нажмите «ОК» и откройте дверцу автоматического генератора капель. Загрузите пластины для генерации образцов и капель и другие материалы, необходимые для эксперимента, в соответствующие места внутри прибора и закройте дверцу.

Когда сенсорный экран загорится зеленым цветом, указывая на то, что все материалы были загружены в правильное положение, выберите масло для зондов и начните генерацию капель. Дождитесь завершения генерации капель в соответствии со временем, указанным на экране. Когда на экране появится сообщение «Капли готовы», откройте дверцу, чтобы удалить пластину, содержащую капли, и используйте запайщик пластин в течение пяти секунд при температуре 180 градусов Цельсия, чтобы запечатать пластину с помощью прокалываемой фольги.

В течение 30 минут после образования капель поместите герметичную пластину для капель в термоциклер глубиной 96 скважин. Установите объем образца на 40 микролитров и температуру крышки на 105 градусов Цельсия. Затем ПЦР амплифицирует капли.

Для считывания показаний капель после усиления перенесите термоциклированную 96-луночную пластину в считыватель капель и откройте сопутствующее программное обеспечение на компьютере, подключенном к считывателю капель. В режиме настройки выберите «Создать» и дважды щелкните любую скважину, чтобы открыть диалоговое окно редактора скважины. Выберите лунки для считывания и установите эксперимент на абсолютное количественное определение, супермикс на капельную цифровую ПЦР-суперсмесь для зондов.

Нацеливайте один тип на канал 1 неизвестный, а два типа — на канал 2 неизвестный. Назначьте имена образцов на основе макета пластины, нажмите «Применить» и «ОК». После сохранения шаблона нажмите кнопку Выполнить.

По запросу программного обеспечения выберите цвет FAM/HEX. По окончании сбора данных снимите пластину со считывателя. Прежде чем анализировать данные, проверьте данные со всех скважин, чтобы получить общее количество капель.

И установите пороговое значение, чтобы принять минимальное количество капель, которые будут считаться положительными или отрицательными результатами. Для симплексного и дуплексного анализа дважды щелкните файл QLP, который нужно проанализировать, и выберите «Анализировать». Используйте инструменты 1D-амплитуды и 2D-амплитудного порога, чтобы различать положительные и отрицательные капли для каждой скважины в правильном канале, используя в качестве ориентира контрольные образцы шаблона узла и положительные контрольные образцы.

Затем экспортируйте результаты в виде CSV-файла для дополнительного анализа. Для анализа смеси триплексных зондов откройте файл QLP и выберите скважины для анализа на вкладке редактора пластин. Задайте тип эксперимента на прямое количественное определение, а анализ на триплекс смеси зонда и введите имя цели.

Затем нажмите «Применить». Используйте инструменты построения графиков, чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам в соответствии с предложениями всплывающего окна выбора для назначения кластера. Когда все целевые цвета будут назначены, данные количественного определения будут отображаться в окне данных скважины.

Экспортируйте данные в виде CSV-файла для последующего анализа. Для квадруплексного анализа установите тип эксперимента на прямое количественное определение, а анализ — на амплитудный мультиплекс. Введите целевое имя и нажмите кнопку Применить.

Используйте инструменты построения графиков, чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам в соответствии с предложениями всплывающего окна выбора для назначения кластера. Когда все целевые цвета будут назначены, данные количественного определения будут отображаться в окне данных скважины. Экспортируйте данные в виде CSV-файла для дополнительного анализа.

Как было отмечено в этом репрезентативном анализе температурного градиента, более высокие температуры колена не могли четко отличить положительные капли от отрицательных при проведении дуплексного анализа. Однако при снижении температуры стоя на коленях было достигнуто оптимальное разделение между положительными и отрицательными каплями. Используя двухцветную цифровую систему обнаружения капель RT, можно обнаружить одну, две, три и четыре мишени SARS-CoV-2 в одном образце.

Контрольный образец без шаблона можно использовать для обнаружения отрицательных капель, чтобы помочь установить отрицательный порог в симплексных анализах. В дуплексных анализах анализ может выполняться в отдельных каналах или в 2D-амплитуде. Хотя анализ данных мультиплексных анализов более высокого порядка не является простым, эти анализы полезны, поскольку они позволяют оценить до восьми кластеров капель в анализах триплексной зондовой смеси и до 16 кластеров капель для анализов на основе квадруплексной амплитуды.

В зависимости от анализа, который будет разработан, убедитесь, что в основную смесь добавлены правильные целевые праймеры и концентрации зонда. Используя эту процедуру, можно чередовать мишени для разработки новых анализов ОТ-дПЦР. Эти анализы могут быть использованы для различных исследовательских целей или для диагностики возникающих инфекционных заболеваний.

С момента своего развития этот метод использовался для точного определения копий вирусных нуклеиновых кислот в различных стандартах, организме человека и образцах окружающей среды.