Направленная индукция органоидов сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека
21 апреля 2021 г.
Используя самоорганизующийся метод, мы разрабатываем протокол с добавлением COCO, который может значительно увеличить генерацию фоторецепторов.
Это модель заболевания сетчатки и эмулирует сетчатку in vivo. В какой-то степени он может заменить эксперименты на животных. Протокол оптимизирован для качества и количества предшественников фоторецепторов в органоидах сетчатки, а фоторецептор является ключом к нескольким необратимым состояниям слепоты.
Начните с культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток, или hESCs, в условиях, свободных от кормушек. Для этого покройте одну лунку шестилуночной пластины одним миллилитом 100 микрограммов на миллилитр реагента А и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в течение не менее получаса. Разморозьте аликвоту в один миллион hESC и центрифугируйте ее при 200 xg в течение пяти минут.
После удаления супернатанта засейте клетки в ранее покрытую пластину вместе с двумя миллилитрами реагента B.Проходя клетки после достижения примерно 80%-ной конфлюзии примерно через четыре дня. Достигнув слияния, промыть клетки предварительно подогретым DPBS, и переложить их в 500 микролитров свежеприготовленного реагента. Затем инкубируют клетки в течение 3,5 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.
Отсоедините ячейки, щелкнув боковой и нижней частью пластины на несколько секунд, и добавьте 500 микролитров подготовленной среды. Соберите отсоединенные ячейки в новую 1,5-миллилитровую трубку и пипетку клеточной суспензии вверх и вниз. Для подсчета клеток добавьте 100 микролитров клеточной суспензии к 900 микролитрам DPBS.
Разбавьте 900 микролитров оставшейся клеточной суспензии средним в чашке Петри, чтобы достичь девятикратного 10-четвертого уровня мощности ячеек на миллилитр. Добавьте 100 микролитров разбавленной клеточной суспензии к каждой лунке неадгезионной пластины с V-образным дном, 96-луночной пластиной. Слегка вращайте пластину на низкоскоростном шейкере в течение пяти минут и насиживайте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до второго дня.
На второй день добавьте 20 микролитров 1% реагента А к каждой лунке 96-луночной пластины и пипетку дважды в центре, чтобы рассеять мертвые клетки. Очистите нижнюю часть пластины перед инкубацией при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до шестого дня. На шестой день замените 58 микролитров среды на 60 микролитров свежей среды и продолжите инкубацию.
На 12-й день соберите гранулы клеток с 96-луночной пластины в 15-миллилитровой конической трубке и дайте гранулам естественным образом осесть в течение пяти минут при комнатной температуре. Когда гранулы осядут, удалите супернатант, не нарушая органоидов, и перенесите клеточные агрегаты в 10-сантиметровую суспензионную чашку, содержащую 18 миллилитров среды два с реагентом A.Инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до 18 дня. На 18-й день подтвердите генерацию полупрозрачного зрительного пузырька в посуде и вырежьте сгенерированные органоиды с помощью микрохирургического ножа.
Сложите все нарезанные гранулы к центру блюда. Затем соберите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку Falcon. Когда клетки осядут, аккуратно удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в двух 10-сантиметровых чашках Петри с 18 миллилитрами среды, по три на чашку.
Аккуратно перенесите посуду в инкубатор, чтобы избежать агрегации клеток. Продолжайте культивировать клетки, меняя среду еженедельно. Анализ экспрессии CRX после 45-го дня до 120-го дня.
В этом репрезентативном анализе отображаются различные стадии генерации сетчатки человека. На шестой день органоиды появились в виде совокупности плотных соединений внутри яркого обода диаметром около 600 микрометров. На 12-й день произошло первоначальное поколение оптических пузырькообразных структур.
Органоиды без надлежащей пузыреобразной архитектуры были выброшены перед культивированием в чашке Петри на 18-й день. К 30-му дню культуры архитектура, похожая на везикл, была более очевидной, и более низкие RO можно было легко различить и удалить. Начиная с 45-го дня, органоиды экспрессировали различные маркеры предшественников фоторецепторов, таких как CRX, RCVRN и OTX2.
Путем расщепления высших органоидов сетчатки эффективность дифференцировки значительно улучшается, и можно извлечь более 100 высших органоидов из 96 пластин.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен оптимизированный протокол получения трехмерных органоидов сетчатки (RO) человека из плюрипотентных стволовых клеток (PSCs). Данный метод повышает эффективность дифференцировки предшественников фоторецепторов, обеспечивая надежную платформу для моделирования заболеваний сетчатки, скрининга лекарственных препаратов и потенциальной клеточной трансплантационной терапии.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Моделирование заболеваний сетчатки
- Трансплантация клеток
Обзор
- Трансплантация клеток сетчатки дает надежду на восстановление зрения при дегенеративных заболеваниях сетчатки.
- Текущие проблемы включают поиск высококачественных стандартизированных образцов сетчатки человека для исследований и терапии.
- Животные модели имеют ограничения в воспроизведении архитектуры и патологий сетчатки человека.
- Для развития исследований и терапевтического применения необходимы эффективные протоколы получения органоидов сетчатки из PSCs.
Цель исследования
- Разработать стабильный и эффективный протокол получения органоидов сетчатки человека из ПСК.
- Оптимизировать выход и качество предшественников фоторецепторов в этих органоидах.
- Создать масштабируемую систему, подходящую для моделирования заболеваний, скрининга лекарственных препаратов и трансплантации.
Используемые методы
- Культивирование эмбриональных стволовых клеток человека (hESCs) в бесфидерных условиях с использованием реагента A для покрытия и реагента B для среды.
- Посев и агрегация клеток в неналипающих 96-луночных планшетах с V-образным дном для стимуляции формирования органоидов.
- Последовательная смена среды и ручное извлечение органоидов для отбора наиболее качественных везикулоподобных структур.
- Длительное культивирование с еженедельной сменой среды и анализ экспрессии маркеров фоторецепторов (например, CRX, RCVRN, OTX2) с 45-го по 120-й день.
- Использование экзогенных молекул, включая COCO, для повышения эффективности дифференцировки фоторецепторов.
Основные результаты
- Эффективное получение ретинальных органоидов, демонстрирующих ключевые стадии развития сетчатки, включая структуры, подобные оптическому пузырю.
- Превосходные органоиды экспрессируют специфические маркеры предшественников фоторецепторов, начиная с 45-го дня.
- Ручной отбор и эксцизия повышают качество и выход органоидов, богатых фоторецепторами.
- Из 96-луночных планшетов можно получить более 100 высококачественных органоидов.
Выводы
- Оптимизированный протокол позволяет стабильно получать органоиды сетчатки человека с высоким содержанием предшественников фоторецепторов.
- Данная система представляет собой масштабируемую и биорелевантную платформу для исследования заболеваний сетчатки и разработки методов терапии.
- Органоиды сетчатки, полученные из ПСК, могут потенциально снизить зависимость от моделей на животных и решить проблемы с получением первичной ткани сетчатки человека.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Направленная индукция ретинальных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека отвечает критической потребности в стандартизированных, масштабируемых и биорелевантных моделях тканей сетчатки для ранних этапов поиска лекарственных средств и моделирования заболеваний. Эта платформа позволяет проводить прогностическую оценку биологии сетчатки, обеспечивая механистическое снижение рисков и валидацию мишеней для терапии, направленной на борьбу с дегенерацией фоторецепторов. Воспроизводимость и масштабируемость данного протокола делают его стратегически важным инструментом для трансляционных исследований и продвижения доклинических разработок.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать механизмы заболеваний сетчатки в системе, релевантной человеку.
- Обеспечивает функциональную валидацию специфических мишеней фоторецепторов с использованием показателей, полученных на основе органоидов.
- Способствует снижению механистических рисков путем моделирования релевантных заболеванию путей in vitro.
- Обеспечивает возобновляемый источник стандартизированной ткани сетчатки для исследований, основанных на проверке гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные системы органоидов для количественной оценки влияния соединений на дифференцировку фоторецепторов.
- Обеспечивает воспроизводимое и масштабируемое получение ретинальных органоидов для рабочих процессов высококонтентного скрининга.
- Поддерживает стандартизацию анализа за счет отбора наиболее качественных органоидов на основе маркерного анализа.
- Повышает надежность скрининга за счет минимизации вариабельности, связанной с использованием первичных тканей.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует фенотипам, значимым для заболевания, что способствует поиску трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации на моделях ретинальной дегенерации.
- Снижает зависимость от моделей на животных, предоставляя специфичную для человека платформу для исследований эффективности и токсичности.
- Позволяет принимать решения о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков на основе функциональных данных, полученных из органоидов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный протокол интегрируется в непрерывный процесс исследований: от раннего моделирования заболеваний и валидации мишеней до разработки анализов и доклинических исследований, обеспечивая идентификацию ведущих соединений и непрерывность трансляционного перехода.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей в контексте заболеваний сетчатки.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые, валидированные по маркерам органоиды для количественной оценки соединений.
- Аналитика: позволяет измерять экспрессию маркеров фоторецепторов (например, CRX, RCVRN, OTX2) для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывает этап фундаментальных открытий и доклиническую валидацию с помощью моделей человеческих тканей, релевантных конкретным заболеваниям.
- Корпоративное использование: предлагает масштабируемую, возобновляемую платформу, адаптируемую для различных программ исследований сетчатки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозов и снижает неопределенность механизмов при валидации мишеней в сетчатке.
- Операционная ценность: стандартизирует и масштабирует производство тканей сетчатки для использования в различных программах.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних этапах в портфелях препаратов для сетчатки.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации с учетом рисков и продвижению терапевтических кандидатов для лечения сетчатки.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с культурами плюрипотентных стволовых клеток и дифференцировкой органоидов.
- Необходим доступ к специализированной инфраструктуре для культивирования клеток и аналитическим инструментам для валидации маркеров.
- Требуется межкомандная стандартизация критериев отбора оптимальных органоидов.
- Может потребоваться адаптация для конкретных моделей заболеваний или классов соединений.
- Зависит от стабильности поставок и контроля качества реагентов и клеточных линий.
