Оценка агрохимического риска для спаренных пчелиных маток

Этот протокол был разработан для улучшения понимания того, как агрохимикаты влияют на размножение медоносных пчел(Apis mellifera),путем установления методов воздействия на матки медоносных пчел и их работников-смотрителей агрохимикатов в контролируемых лабораторных условиях и тщательного мониторинга их соответствующих ответов.

Агрохимическое воздействие может оказать серьезное воздействие на всех членов колонии медоносных пчел, включая наиболее важного члена, маток. Но до недавнего времени было доступно мало инструментов для изучения этих эффектов. Этот метод позволяет исследователям подвергать маток воздействию агрохимикатов в контролируемых условиях, которые имитируют условия, которые они могут испытывать в поле.

Довольно легко нарушить поведение яйцекладки маток медоносных пчел, поэтому важно проявлять осторожность при обращении с рабочими и матками до и во время эксперимента. Демонстрировать эти процедуры будут Эми Флойд и Элиза Лици, лаборанты в Отделе исследований инвазивных видов и опылителей, Исследовательская лаборатория медоносных пчел. Для начала соберите клетки для мониторинга маток или QMC, вставив дверные панели, а затем вставьте исключающий маток в дверцу камеры кормления над камерой кормления, чтобы матка не входила и не контактировала с обработанной диетой.

Вставьте один ELP. Не добавляйте питательные трубки до тех пор, пока рабочие не будут добавлены в клетку, и временно закройте четыре отверстия питателя лентой лабораторного класса. После сбора и инкубации восковых сотовых рамок, содержащих закрытый рабочий расплод из колоний медоносных пчел, смахните закрытых пчел в открытый контейнер, выстланный барьерной краской для насекомых, чтобы пчелы не выползли.

Добавьте не менее 50 пчел по весу в яйцекладущую камеру каждого QMC. Чтобы обеспечить введение разнообразного генетического пула, получите аналогичное количество рабочих пчел по крайней мере из трех колоний и позвольте им смешиваться перед добавлением пчел в QMC. Добавьте кормушки, содержащие раствор сахарозы, воду и пыльцевую добавку.

Используйте маток, приобретенных у коммерческого заводчика в течение 48 часов с момента получения. Пока королева все еще находится внутри транспортной клетки, поместите ее в прозрачный пластиковый пакет. Затем поместите один конец пластиковой трубки, соединенной с баллончиком с углекислым газом, внутрь пакета и осторожно откройте клапан канистры, чтобы позволить газу углекислого газа течь.

Когда мешок был накачан газом, одновременно закройте клапан канистры и держите мешок закрытым, чтобы улавливать газ внутри. Держите мешок закрытым в течение 30 секунд или до тех пор, пока королева не перестанет двигаться. Удалите матку, открыв клетку для транспортировки, как только королева окажется без сознания.

Частично откройте дверь в яйцекладущую камеру, аккуратно поместите внутрь бессознательную матку и закройте крышку. Добавьте второй ELP к каждому QMC. Поместите кусок лабораторной ленты поверх двух ELP, чтобы они не отделялись от рамы QMC, и предотвратите выход рабочих из клетки.

Поместите клетки в темный инкубатор со стабильными условиями окружающей среды от 34 до 35 градусов цельсия и относительной влажностью 50-70%. Для введения диеты, сдобренной агрохимикатами, приготовьте исходные растворы агрохимикатов в соответствующем растворителе, таком как ацетон, в концентрации, которая может быть добавлена в рацион для достижения желаемой конечной концентрации интересующего агрохимиката. Вводите агрохимическую обработку в растворе сахарозы, коммерческой добавке пыльцы или и в том, и в другом.

Подготовьте экспериментальную диету к применению в тот же день, добавив соответствующее количество бульонного раствора до охлажденной или комнатной температуры, 50%-ного раствора сахарозы. Тщательно перемешайте путем вихря на средней скорости. Для пыльцевых добавок добавьте рассчитанное количество раствора агрохимикатов в раствор сахарозы и тщательно вихрьте перед добавлением его в порошкообразную добавку.

Добавьте рацион в питательные трубки и запишите вес кормушки перед размещением их в QMC. Чтобы количественно оценить откладку яиц, начните с удаления QMC из инкубатора. Осмотрите заднюю часть прозрачных ELP, если яйца присутствуют, снимите дверную панель перед интересующей пластиной.

Снимите ленту с поперек ELP и сдвиньте дверную панель между ELP и пчелами внутри QMC. Установив дверную панель, снимите ELP и подсчитайте и запишите количество яиц внутри клеток ELP. Удалите яйца, постукивая краем ELP открытой клеточной стороной вниз, на твердой поверхности.

Как только яйца выпадут, замените пустой ELP в QMC. Аккуратно снимите и замените дверную панель за ELP на внешней стороне QMC. Повторите по мере необходимости второй ELP и замените ленту на QMC по завершении.

Чтобы контролировать потребление пищи, заменяйте пищу свежеприготовленной диетой каждые два дня. Подготовьте новые питательные трубки и взвесьте их перед началом мониторинга производства яиц. Замените старые трубки на новые и взвесьте старые трубки, прежде чем утилизировать их.

Сравните конечный вес питательной трубки и непотребленного рациона с весом той же трубки, чтобы оценить потребление рациона. Проверяйте один раз в день, чтобы убедиться, что кормушки никогда не пустуют. Если трубка питателя пуста или почти пуста, удалите ее, пополните ее, запишите вес трубки до и после и добавьте разницу к общему потреблению двухдневной диеты для QMC.

В выбранной точке во время эксперимента QMC удалите ELP, содержащие свежеотложенные яйца, из QMC, как описано ранее, но не вытесняйте яйца из ELP. Накройте ELP сначала уплотнением пластины ПЦР, а затем универсальной крышкой микропластины, и поместите его внутрь адсорбатора с насыщенным раствором сульфата калия. Оцените скорость вылупления примерно через 78 часов после удаления ELP из QMC.

С-образная личинка в нижней части клетки свидетельствует об успешном вылуплении. Если QMC были заполнены избыточными рабочими, возьмите образцы рабочих пчел в выбранный момент времени во время эксперимента, чтобы оценить вызванные лечением изменения в их физиологии. Перед отбором проб поместите дверную панель между ELP и внутренней частью QMC и снимите ELP.

Осторожно поднимите дверную панель примерно на 0,5 сантиметра от основания клетки и извлеките рабочую пчелу изнутри QMC с помощью полулегкого пинцета. Для анализа экспрессии генов заморозьте пчел в жидком азоте и храните их при 80 градусах Цельсия. Сохраните собранную пчелу для последующего анализа и повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет собрано желаемое количество образцов.

Диетические изменения, связанные с лечением имидаклопридом, в суточном количестве яиц оценивались путем реализации линейного обобщенного оценочного уравнения Пуассона с авторегрессивной корреляционной матрицей. Суточная яйценоскость была значительно ниже в QMC, получая пыльцевую добавку и сахарозу, содержащую 50 частей на миллиард имидаклоприда. Дозозависимый эффект наблюдался на общее количество яйцеклеток, продуцированных в каждом QMC для лечения имидаклопридом, вводимого как в сахарозе, так и в пыльцевой добавке.

При наибольшем сокращении, наблюдаемом в QMC, кормили 50 частями на миллиард имидаклоприда, за которым следовали 10 частей на миллиард в пыльцевой добавке плюс сахароза. Не наблюдалось никакой разницы в общем количестве произведенных яиц между контролем и QMC, получавшими 10 частей на миллиард имидаклопридов и пыльцевых добавок. Потребление пыльцы, воды и сахарозы регистрировали каждые 48 часов в течение 10 или 12 дней.

Суточные нормы потребления сахарозы значительно увеличились по мере продвижения эксперимента, но показатели потребления добавок пыльцы снизились. Более высокие темпы потребления пыльцы наблюдались, когда 10 частей на миллиард имидаклопридов вводились только в пыльцевой добавке. И скорость уменьшалась, когда 10 или 50 частей на миллиард вводили в пыльцевой добавке и растворе сахарозы вместе.

Использование дневных пчел имеет решающее значение для обеспечения принятия матки и уменьшения реактивации работника. Также критически важным является бережное обращение с маткой и поддержание клеток в стабильной среде.