Мониторинг белково-лигандных взаимодействий в клетках человека с помощью количественного внутриклеточного ЯМР в режиме реального времени с использованием биореактора высокой плотности клеток
9 марта 2021 г.
Этот протокол описывает настройку биореактора ЯМР для поддержания жизнеспособности инкапсулированных клеток человека в течение 72 ч, с последующим сбором и анализом внутриклеточных данных ЯМР с временным разрешением. Методика применяется для мониторинга внутриклеточных белково-лигандных взаимодействий в режиме реального времени.
Внутриклеточная ЯМР-спектроскопия предлагает уникальный подход к изучению структуры и функции белка непосредственно в живых клетках и мониторингу биологически значимых процессов, таких как белково-лигандные взаимодействия. Этот биореактор ЯМР может поддерживать высокое количество клеток человека жизнеспособными и метаболически активными в течение нескольких дней в спектрометре, что позволяет применять ЯМР в клетках в режиме реального времени. Этот метод может быть применен к любому растворимому, свободно кувыркающемуся внутриклеточному белку, претерпевающему конформационные или химические изменения.
Маркировка изотопов еще больше расширяет применимость метода. Для начала соберите проточный блок с помощью трубки ЯМР второго проточного блока, которая позже будет заменена на ту, которая содержит ячейки. Обратитесь к инструкциям по эксплуатации проточного блока для правильной сборки.
Установите водяную баню, подключенную к блоку измерения температуры проточной единицы, на 37 градусов Цельсия и поместите бутылку резервуара в водяную баню. Подключите трубку FEP баллона резервуара к насосу. Поверните клапан биореактора, чтобы обойти и предварительно заполнить насос средой.
Затем поверните клапан биореактора в поток и предварительно заполните биореактор средой со скоростью 0,1 миллилитра в минуту. Возьмите из инкубатора углекислого газа колбу T75 с трансфектированными HEK 293 Т-клетками и удалите отработанную среду. Добавьте два миллилитра трипсина ЭДТА в клетки и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы отделить клетки.
Инактивируют трипсин 20 миллилитрами полного DMEM и тщательно повторно приостанавливают клетки путем пипетирования вверх и вниз. Затем переложите их в 50-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте ячейки при 800X G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте супернатант.
Перенесите гранулу ячейки в 1,5-миллилитровую колпачковую микроцентрифужную трубку. Чтобы встроить ячейки в агарозные нити, расплавьте одну аликвоту затвердевшей агарозы при 85 градусах Цельсия в блок-нагревателе, затем храните ее в растворе при 37 градусах Цельсия в блок-нагревателе. С помощью пипетки Пастера заполните дно проточной трубки ЯМР от 60 до 70 микролитров 1,5% агарозного геля и поместите его на лед, чтобы создать нижнюю пробку высотой пять миллиметров.
Нагревайте ячейку гранулы в течение 15-20 секунд в блок-нагревателе и осторожно повторно подвешивайте ячейки в 450 микролитрах раствора агарозы, избегая образования пузырьков. Аспирировать клеточную/агарозную суспензию в 30-сантиметровую хроматографическую трубку PEEK внутреннего диаметра 0,75 миллиметра, соединенную со шприцем длиной в один миллилитр. Дайте трубке остыть при комнатной температуре в течение двух минут.
Предварительно заполните проточную трубку ЯМР 100 микролитрами PBS при комнатной температуре. Литые нити ячеек, встроенных в агарозу, в проточную установку ЯМР-трубки путем осторожного нажатия шприца. Извлеките пустую ЯМР-трубку из проточного блока и увеличьте расход до двух миллилитров в минуту в течение нескольких минут, чтобы удалить остаточные пузырьки газа во входной трубке.
Установите скорость потока на 0,2 миллилитра в минуту и вставьте ЯМР-трубку, содержащую ячейки, медленно, но неуклонно подталкивая ее вверх. Подавайте в биореактор среду со скоростью потока 0,1 миллилитра в минуту. Установите температуру в ЯМР-спектрометре на 310 Кельвинов и вставьте блок потока в спектрометр.
После того, как биореактор вставлен в ЯМР-спектрометр, подождите несколько минут, чтобы обеспечить обмен среды. Отрегулируйте согласование и настройку протонного канала, нажмите на магнит и рассчитайте длину жесткого импульса протона 90 градусов. Отрегулируйте уровни мощности протонов в каждой последовательности импульсов в соответствии с жестким импульсом протона.
Запишите первый протонный ЯМР-спектр zgesgp для записи содержания образца в однородности поля. Скопируйте эксперименты zgesgp и p3919gp или SOFAST-HMQC на нужное число и поставьте их в очередь в диспетчере очереди получения. Вводят концентрированный раствор внешней молекулы в бутылку со средним резервуаром, прокалывая силиконовую трубку стерильным длинноигольчатым шприцем.
В конце эксперимента С ЯМР замените трубку, содержащую ячейки, пустой трубкой и промойте проточный блок водой. Для клеток, экспрессирующих немаркированную карбоангидразу, обработайте спектры p3919gp, применяя функцию нулевого заполнения и экспоненциального окна расширения линии. Для клеток, экспрессирующих азот-15, меченую супероксиддисмутазой, обрабатывайте спектры SOFAST-HMQC, применяя функцию нулевого заполнения и колокольного окна с квадратным знаком в обоих измерениях.
В MATLAB импортируйте спектральные области с помощью пользовательского скрипта Load_ascii_spectra. Запустите сценарий Load_acqus, чтобы извлечь метки времени из 1D-спектров. Откройте графический интерфейс MCR-ALS 2.0, выполнив сценарий mcr_main, и на вкладке Выбор данных загрузите матрицу спектров.
Проверьте данные, построив их. Оцените количество компонентов либо путем разложения сингулярных значений, либо вручную, и выберите метод начальной оценки чистых спектров. Можно использовать либо чистейшее обнаружение переменных, либо эволюционирующий факторный анализ.
В окне Выбор набора данных нажмите кнопку Продолжить. Задайте ограничения для концентраций в окне Ограничения:режим строки. Примените ограничение без негатива, выбрав fnnls в качестве реализации и два в качестве количества видов.
Затем примените одно ограничение закрытия, установите ограничение на единицу, условие ограничения закрытия равно и примените ко всем видам. Задайте ограничения для спектров в окне Ограничения:режим столбца. Примените ограничение неотрицательности, выбрав fnnls в качестве реализации и два в качестве количества видов.
В последнем окне задайте 50 итераций и критерий сходимости 0,01. Укажите выходные имена для концентраций, спектров и стандартного отклонения. Нажмите «Продолжить», чтобы запустить фитинг MCR-ALS.
Клетки в биореакторе могут поддерживаться живыми до 72 часов, что подтверждается тестом трипан-синего цвета. Биореактор использовался для мониторинга в режиме реального времени связывания двух ингибиторов, ацетазоламида и метазоламида с карбоангидразой, сверхэкспрессированной в цитозоле ГЕК-293 Т-клеток. Наличие сигналов от сверхэкспрессированного белка и однородность поля оценивали с помощью первого возбуждающе-скульптурного протонного спектра.
В случае карбоангидразы внутриклеточное связывание двух ингибиторов контролировали путем наблюдения протонных сигналов в области между 11 и 16 частями на миллион спектра УОТЕРГЕЙТА, возникающими из цинк-координационных гистидинов и других ароматических остатков. Успешное связывание подтверждалось появлением дополнительных сигналов. MCR-ALS использовался для разделения сигналов ЯМР, возникающих из свободной и связанной карбоангидразы, и для обеспечения относительных профилей концентраций двух видов.
Биореактор применяли для мониторинга образования связанной с цинком внутримолекулярной дисульфидной связи, поддерживаемой эбселеном, имитацией глутатионпероксидазы. Анализ MCR-ALS на отдельных областях 2D-спектра разделил сигналы, исходящие от двух видов, и предоставил их относительные профили концентрации. Важно вставлять и снимать трубку ЯМР блока потока медленно и устойчиво, чтобы избежать скачков давления, которые могут вызвать образование пузырьков.
Разработка биореакторов ЯМР проложила путь к изучению процессов, зависящих от времени с атомным разрешением, таких как построение регуляции редукции и взаимодействия лекарств / мишеней в живых клетках.
Обзор
В данной статье подробно описывается применение внутриклеточного ЯМР-спектроскопии в сочетании со специализированным ЯМР-биореактором для мониторинга взаимодействий белок-лиганд и химических модификаций белков в живых клетках человека. Описанный рабочий процесс позволяет в режиме реального времени наблюдать за внутриклеточными процессами с атомным разрешением, преодолевая традиционные ограничения жизнеспособности клеток внутри ЯМР-спектрометра. Протокол включает подготовку образцов, настройку биореактора, сбор данных ЯМР и количественный анализ с использованием многокомпонентного разрешения кривых (MCR-ALS).
Основные компоненты исследования
Область науки
- Структурная биология
- Клеточная биохимия
- ЯМР-спектроскопия
Теоретические основы
- ЯМР внутри клеток позволяет напрямую наблюдать за структурой и динамикой белков в живых клетках.
- Традиционный внутриклеточный ЯМР ограничен коротким временем жизнеспособности клеток в спектрометре.
- ЯМР-биореакторы позволяют продлить жизнеспособность клеток, что делает возможным проведение более длительных экспериментов и мониторинг в режиме реального времени.
- Количественный анализ данных ЯМР в живых клетках затруднен из-за сложного перекрытия сигналов и динамических изменений.
Цель исследования
- Предоставить детальный протокол использования ЯМР-биореактора для поддержания жизнеспособности человеческих клеток в течение длительного времени во время проведения ЯМР-экспериментов.
- Продемонстрировать мониторинг белок-лигандных взаимодействий и модификаций белков в живых клетках в режиме реального времени.
- Представить рабочий процесс для количественного анализа данных внутриклеточного ЯМР в режиме реального времени с использованием метода MCR-ALS.
Используемые методы
- Подготовка трансфицированных клеток HEK 293T и их встраивание в агарозные нити.
- Сборка и эксплуатация ЯМР-биореактора с термостабилизацией и непрерывным потоком среды.
- Сбор данных внутриклеточного ЯМР в режиме реального времени, включая 1D и 2D эксперименты (например, SOFAST-HMQC).
- Количественный анализ ЯМР-спектров с использованием метода многомерного разрешения кривых с помощью алгоритма переменныx наименьших квадратов (MCR-ALS) в MATLAB.
Основные результаты
- Биореактор поддерживал высокую жизнеспособность и метаболическую активность клеток на протяжении до 72 часов.
- Был осуществлен мониторинг в реальном времени связывания ингибиторов (ацетазоламида, метазоламида) с карбоангидразой в живых клетках.
- Метод MCR-ALS позволил разделить и количественно определить свободные и связанные формы белка в динамике.
- Система также использовалась для мониторинга химических модификаций белка, таких как образование дисульфидных связей в супероксиддисмутазе, индуцированное эбселеном.
Выводы
- Установка ЯМР-биореактора позволяет проводить длительные исследования взаимодействий белков с лигандами и их модификаций методом внутриклеточного ЯМР в режиме реального времени.
- Метод MCR-ALS обеспечивает надежный количественный анализ сложных временных рядов данных ЯМР в живых клетках.
- Данный подход расширяет возможности изучения динамических биологических процессов и взаимодействий «лекарство-мишень» с атомарным разрешением в клеточном контексте.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественный ЯМР в клетках в режиме реального времени с использованием биореактора высокой плотности позволяет осуществлять прямой мониторинг взаимодействий белок-лиганд и химических модификаций в живых клетках человека с атомарным разрешением. Эта возможность восполняет критический пробел на ранних этапах разработки лекарственных средств, предоставляя динамические количественные данные о взаимодействии с внутриклеточными мишенями и механизмах протекания процессов. Данный подход повышает точность прогнозов на этапах валидации мишени и оптимизации соединений-лидеров, что способствует принятию обоснованных решений по управлению портфелем проектов с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую наблюдать связывание белка с лигандом и конформационные изменения в естественном клеточном контексте.
- Поддерживает механическую проверку гипотез (дерискинг) за счет количественной оценки внутриклеточного взаимодействия с мишенью в режиме реального времени.
- Обеспечивает получение кинетических профилей и профилей концентрации для функциональной валидации мишени.
- Способствует отбору мишеней на основе динамических количественных показателей.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение валидированных, воспроизводимых биологических систем для последующих рабочих процессов скрининга.
- Позволяет получать количественные данные анализа с временным разрешением для оценки соединений.
- Поддерживает стандартизацию анализа и масштабируемость платформы за счет стабильной работы биореактора.
- Повышает готовность к скринингу, поддерживая высокую жизнеспособность и метаболическую активность клеток.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет данные о взаимодействии с внутриклеточными мишенями с соответствующими клеточными моделями заболеваний.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа поиска до доклинической валидации за счет отслеживания модификаций и взаимодействий белков в режиме реального времени.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков на основе количественных данных на клеточном уровне.
- Поддерживает разработку трансляционных биомаркеров путем установления связи между молекулярными событиями и функциональными результатами.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод интегрируется в процесс разработки лекарственных средств — от ранней валидации мишени до идентификации соединений-лидеров и доклинических исследований, предоставляя многократно используемую платформу для количественного анализа взаимодействий белков с лигандами в живых клетках в режиме реального времени.
- Фундаментальная биология: Поддерживает проверку гипотез и уточнение сигнальных путей посредством мониторинга динамических внутриклеточных процессов.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты анализов для оценки и оптимизации соединений.
- Аналитика: Позволяет получать профили концентрации и кинетические параметры с помощью анализа методом многокомпонентного разложения кривых (MCR-ALS).
- Трансляционные исследования: Связывает этапы поиска и доклинических исследований, обеспечивая мониторинг в режиме реального времени в моделях человеческих клеток, релевантных для конкретных заболеваний.
- Корпоративное использование: Устанавливает стандартизированный масштабируемый рабочий процесс для многократного применения в различных мишенях и программах.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и уменьшает механистическую неопределенность при валидации мишеней.
- Операционная ценность: Повышает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов ЯМР в клетках.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления количественных данных в реальном времени.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию с учетом рисков и продвижение программ по поиску новых лекарственных средств.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области ЯМР-спектроскопии, культивирования клеток и количественного анализа данных.
- Необходимы специализированные приборы, включая биореактор с ЯМР и контролем температуры, а также система непрерывного потока среды.
- Требуется стандартизация между исследовательскими группами в отношении протоколов подготовки образцов, сбора и анализа данных.
- Метод применим к различным растворимым, свободно вращающимся внутриклеточным белкам с возможностью изотопного мечения.
- Для обеспечения качества и воспроизводимости данных необходимо тщательно поддерживать жизнеспособность и метаболическую активность клеток.
