Протокол подготовки и передачи образцов для внутривакуумной длинноволновой кристаллографии на лучевой линии I23 на алмазном источнике света

Длинноволновая макромолекулярная кристаллография использует аномальный сигнал от атомов света, изначально присутствующих в белках и нуклеиновых кислотах. Данная методика используется для экспериментального решения кристаллографической задачи лица и определения идентичности и расположения этих элементов. Beamline I23 at Diamond Light Source - это уникальный синхротронный прибор, оптимизированный для экспериментов на длинных волнах до пяти ангстрем.

Это позволяет получить доступ к краям поглощения элементов высокой биологической значимости, таких как кальций, калий, хлор, сера и фосфор. Из-за значительного поглощения рентгеновских лучей воздухом в длинноволновом режиме эти эксперименты проводятся в вакуумной среде. Для поддержания образцов при криогенных температурах внутри вакуумной среды кристаллы устанавливаются на специальные термопроводящие держатели образцов.

Криогенный перенос образца из жидкого азота на вакуумную конечную станцию очень похож на методы, используемые в криоэлектронной микроскопии. В этом протоколе представлена процедура переноса кристаллов в вакуумную среду с использованием инструментов и оборудования, разработанных в Diamond Light Source. Начните с отделения крышки от основания CombiPuck таким образом, чтобы держатели образцов оставались прикрепленными к основанию, а флаконы удерживались в крышке.

Погрузите крышку с флаконами в жидкий азот, затем прикрепите держатель для образцов и адаптер к магнитной палочке и соберите кристаллы. Промывка охлаждает каждый образец непосредственно в CombiPuck, отмечая положение образца. Чтобы закрыть шайбу, используйте палочку для шайбы, чтобы прикрепить основание к крышке.

Перенесите CombiPuck из жидкого азота в сухой грузоотправитель или хранилище. Поместите основание шайбы блока, уже заполненное пустыми передаточными блоками, на его опорное основание в пенопластовый контейнер, затем заполните жидким азотом. Затем поместите CombiPuck в пенопластовый контейнер, наполненный жидким азотом, убедившись, что основание шайбы закреплено на магнитном держателе внутри пенопластового контейнера.

Предварительно охладите все необходимые инструменты жидким азотом. Затем отделите крышку от основания с помощью инструмента сепаратора шайбы на высокой установке, так что основание остается прикрепленным к магнитному держателю, подвергая держатели образцов внутри жидкого азота. Поместите сепараторную палочку над держателем образца и адаптером как можно дальше вниз, убедившись, что палочка вертикальна.

Переместите небольшой рычаг на палочке сепаратора вниз большим пальцем, пока он не щелкнет, чтобы закрепить держатель образца внутри, и вытащите держатель образца из адаптера. Опустите сепаратор в нужное положение передаточного блока, убедившись, что один из трех зубцов помещается внутри центрального отверстия передаточного блока. Отпустите держатель образца, переместив рычаг обратно вверх.

Чтобы загрузить образцы в следующий блок передачи, используйте инструмент ключа карусели для поворота пустого блока передачи в горизонтальное положение. После того, как все держатели образцов будут переданы, закройте шайбу блока, поместив крышку в жидкий азот. Подождите, пока температура уравновесится, а затем установите крышку над основанием и осторожно поднимите, чтобы освободиться от карусели.

Прикрепите шаттл к станции. Откройте газовые азотные и воздушные клапаны и убедитесь, что газы текут. Затем включите CTS.

Охладите ванну и шаттл жидким азотом. Поместите прилагаемую воронку в заправочное отверстие на шаттле и медленно налейте жидкий азот в воронку, контролируя уровень на экране. Остановитесь, когда индикатор превратится с красного на синий.

Наполните ванну жидким азотом с помощью воронки. Перенесите блочную шайбу из жидкого азота в ванну CTS с помощью прилагаемого инструмента для разделения шайбы. Снимите крышку блок-шайбы и закройте крышку ванны CTS.

Чтобы ввести передаточный блок в шаттл, разблокируйте ручку шаттла, повернув на 90 градусов по часовой стрелке, и переместите ее в сторону ванны, чтобы управляемая дорожка на ручке обеспечивала правильный путь движения. Как только крышка блока остынет, переместите ручку, чтобы ввести блок в шаттл. Чтобы зафиксировать передаточный блок на шаттле, поверните ручку на 180 градусов по часовой стрелке.

Втяните ручку в исходное заднее положение и зафиксируйте ее на месте, повернув на 90 градусов против часовой стрелки. Нажмите Закрыть насос челночного клапана на экране дисплея, чтобы начать эвакуацию шаттла. Как только сообщения Шаттл готов к движению и Не перемещать стержень, клапан закрыт отображаются на сенсорном экране, нажмите на рычаг под шаттлом и осторожно поднимите его с помощью ручки наверху.

Отнесите шаттл к шлюзу на вакуумной конечной станции в вертикальном положении и прикрепите его. Выберите положение пустого блока внутри судна, нажав соответствующую кнопку на сенсорном экране и переместив образец отеля в правильное положение загрузки. Как только образец отеля будет в положении, нажмите кнопку Открыть, чтобы инициировать последовательность вакуумной блокировки.

После того, как последовательность завершена и состояние изменится на Airlock open, блокируйте в шаттле, поверните ручку на 90 градусов по часовой стрелке, чтобы разблокировать стержень. Осторожно втолкните стержень в судно, чтобы направляющаяся дорожка обеспечивала правильный путь движения к образцу отеля. Медленно вставьте блок трансфера в отель, используя видеопоток, отображаемый на экране для руководства, убедившись, что значок положения блока на сенсорном дисплее активирован.

После активации поверните рукоятку на 180 градусов против часовой стрелки, чтобы освободить передаточный блок и вытащить стержень из сосуда. После полного втягивания поверните ручку на 90 градусов против часовой стрелки, чтобы зафиксировать стержень. Нажмите кнопку Close, чтобы закрыть вакуумный клапан конечной станции и выпустить пространство между шаттлом и сосудом под атмосферное давление.

Извлеките шаттл, когда на дисплее блокировки отобразится состояние OK для отсоединения. Верните шаттл в ванну CTS и нажмите «Открытый клапан шаттла», чтобы эвакуировать шаттл перед загрузкой следующего блока образцов. Как только светофор станет зеленым и появится сообщение OK для перемещения стержня, следующий блок передачи может быть введен в шаттл.

Чтобы подготовить следующий трансферный блок, поверните шайбу блока внутрь ванны. Нажмите встроенный ключ вращения на верхней части акриловой крышки вниз в замок в центре блок-шайбы. Удерживая его, поверните ключ, чтобы расположить нужный передаточный блок в положении пикапа.

После того, как все блоки были перенесены, убедитесь, что челночный клапан открыт, нажмите кнопку Bake на сенсорном экране, выберите Bath и Shuttle, затем нажмите Start Bake. Длинноволновая макромолекулярная кристаллографическая лучевая линия I23 в diamond Light Source может получить доступ к краям поглощения элементов высокой биологической важности, таких как кальций, калий, хлор, сера и фосфор, давая усиленный аномальный сигнал, который может быть использован для фазирования или размещения этих элементов в макромолекулах. Дифракционные данные были собраны из одного кристалла тауматина на длине волны 2,75 ангстрема, выбранного в качестве компромисса между повышенным аномальным сигналом и эффектами поглощения образца на более длинных волнах.

Вакуумная установка гарантирует, что только рентгеновские лучи, рассеянные образцом, достигают детектора, обеспечивая низкий фон вокруг отражений Брэгга. Набор данных выдавал очень сильный аномальный сигнал, облегчая структурное решение с помощью автоматического поэтапного трубопровода CRANK2. Высокое качество полученной карты электронной плотности позволило успешно построить автоматическую модель с правильным размещением 100% аминокислотной последовательности тауматина.

16 остатков цистеина в тауматине образуют восемь дисульфидных мостиков, которые хорошо видны на карте электронной плотности. Поскольку вакуумная длинноволновая кристаллография белка является новой областью, мы разработали новые инструменты и оборудование для обработки образцов. Этот протокол помогает пользователям безопасно передавать образцы на вакуумную конечную станцию на лучевой линии I23 в Diamond Light Source.

Вакуумная среда открывает уникальные возможности для проведения дифракционных экспериментов в диапазоне длин волн, недоступном на других линиях луча. Длинноволновая рентгеновская кристаллография позволяет экспериментально фазировать макромолекулы непосредственно из нативных кристаллов. Это также позволяет однозначно идентифицировать ионы, связанные с молекулами.