Анализ липидного состава микобактерий методом тонкослойной хроматографии

Липиды микобактерий являются важной характеристикой рода и имеют решающее значение во взаимодействии микобактерий-хозяев. Скорость и универсальность являются основными преимуществами этой процедуры. Этот метод может быть использован для понимания роли липидов и патогенности микобактерий и их иммуностимулирующих эффектов.

Для экстракции нековалентных связанных липидов добавьте 15 миллилитров от одного до двух хлороформов в раствор метанола в стеклянную трубку с винтовой крышкой из PTFE под ламинарной проточной вытяжкой. Затем выцарапайте 200 миллиграммов микобактерий из твердой среды и добавьте микобактерии в стеклянную трубку. Инкубировать трубку в течение ночи с постоянным перемешиванием.

На следующий день отфильтруйте органические растворители через стеклянную воронку, высточенный фильтровальной бумагой, в стеклянную трубку. После использования потока газообразного азота, чтобы испарить жидкую фазу в трубке, заполнить трубку газообразным азотом, чтобы сохранить трубку при четырех градусах Цельсия. Затем добавляют 15 миллилитров двух-одного хлороформа в раствор метанола к клеточному мусору и инкубируют трубку в течение ночи с постоянным перемешиванием.

На следующее утро дайте смеси отдохнуть в течение одного часа, прежде чем использовать пипетку Пастера для переноса органических растворителей в стеклянную воронку с фильтровальной бумагой в ту же стеклянную трубку для сбора стекла. Затем испарите жидкую фазу, как показано, прежде чем заправлять трубку газообразным азотом для хранения в четыре градуса Цельсия. Для экстракции миколиновой кислотой добавьте от двух до пяти миллилитров перемешивающего раствора и 200 миллиграммов биомассы микобактерий в герметичную стеклянную трубку с винтовой крышкой из PTFE и перемешайте содержимое путем вихря.

Инкубировать смесь внутри сухой ванны при 80 градусах Цельсия в течение ночи. На следующий день, когда трубка остынет комнатной температуры, добавляют два миллилитра N-гексана, и перемешивают содержимое в течение 30 секунд путем вихря. Дайте трубке осесть до тех пор, пока не появятся две четкие фазы, и перенесите верхнюю фазу N-гексана в новую трубку.

Смешайте два дополнительных миллилитра N-гексана с содержимым трубки и снова соберите верхний слой. Затем испарите содержимое трубки потоком азота и сохраните образец, покрытый азотом, при четырех градусах Цельсия, как показано на примере. Для анализа образцов методом TLC накройте одну стенку камеры TLC куском фильтровальной бумаги, добавьте вазелин на углы камеры для герметизации камеры, чтобы смесь растворителей была покрыта фильтровальной бумагой и добавили оставшийся объем растворителя на дно камеры TLC.

Закройте камеру TLC не менее чем на 20 минут, чтобы она насытиться. Между тем, растворите липиды в стеклянной трубке в 200-1000 микролитрах хлороформа и используйте капиллярную стеклянную трубку, чтобы нанести 10 микролитров суспензии липидного хлороформа непосредственно на пластину TLC. После того, как образец высохнет в течение пяти минут, вставьте пластину в насыщенную камеру TLC и позвольте подвижной фазе пройти через TLC.

Когда растворитель достигнет одного сантиметра от верхнего конца пластины, поместите пластину под ламинарной флюс до тех пор, пока кремнезем полностью не высохнет. Затем опрыскивают высушенную пластину от 15 до 20 миллилитров 10%-ных молярных данных гидрат фосфорной кислоты в этаноле до тех пор, пока пластина не ярмнеет, и нагревают пластину в течение двух-пяти минут при 120 градусах Цельсия. В этом репрезентативном анализе миколевая кислота, извлеченная из различных видов микобактерий, была проанализирована с помощью одномерного TLC с использованием двух различных систем элюирования и двухмерного TLC.

Также были выполнены два типа процедур метилирования для подтверждения присутствия миколиновой кислоты пятого типа. В обеих системах элюирования миколовые кислоты располагались примерно в середине пластины, хотя, пятно, соответствующее миколиновой кислоте пятого типа, наблюдалось только после омыления. Двумерный TLC также позволяет идентифицировать отдельные типы миколиновой кислоты.

Например, mycobacterium brumae экспрессирует только миколовые кислоты типа один, mycobacterium bovis BCG экспрессирует тип один и четвертый, mycobacterium fortuitum экспрессирует тип один и пять, а mycobacterium abcessus выражает профили миколиновой кислоты типа один и два. Общие липидные экстракты различных видов микобактерий были проанализированы в функции их полярности и размера. Он показывает, что большинство полярных липидов А, таких как PDIMs, присутствуют в mycobacterium bovis BCG, но не в mycobacterium fortuitum, mycobacterium brumae и гладком морфотипе M abcessus.

Фенольные гликолипиды присутствуют только в микобактерии бовиса БЦЖ, в то время как гликоптидолипиды наблюдаются только в образцах из микобактерии abcessus. Подобно миколовым кислотам, ацилглицеролы и PDIM, PMM, также могут быть легко визуализированы с помощью одномерного TLC или 2D TLC анализа. Два типа пятен были использованы для выявления PEM в одномерном TLC.

Самое главное, что нужно помнить при попытке этого протокола, это не использовать никаких пластиковых инструментов на протяжении всей процедуры.