Анализ городской среды - трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров
9 апреля 2021 г.
Гражданский научный проект был разработан для привлечения жителей Сан-Диего для сбора образцов окружающей среды для SARS-CoV-2. Многоязычная веб-платформа была создана для отправки данных с использованием удобного интерфейса мобильного устройства. Система управления лабораторной информацией облегчила сбор тысяч географически разнообразных образцов с отслеживанием результатов в режиме реального времени.
В этом исследовании представлен новый рабочий процесс для обнаружения SARS-CoV-2 на поверхностях, которые редко очищаются в городской среде, таких как ручки газовых насосов, игровые площадки и банкоматы. В условиях пандемии поставки ограничены. Мы используем легкодоступные материалы, реагенты и оборудование, доступные в основных лабораторных условиях.
Мы используем метод экстракции, который сохраняет РНК без холодовой цепи, и метод обнаружения, устойчивый к ингибиторам. Этот протокол представляет интерес для общественного здравоохранения. Он обеспечивает основу для оценки экологических вирусных резервуаров для текущей пандемии COVID-19 и других инфекционных агентов во время будущих глобальных вспышек.
Привлеките гражданских ученых, используя прямой и четкий призыв к действию, опубликованный через местные и социальные сети. Создайте дескриптор социальных сетей, чтобы связать тему с контентом социальных сетей. Создайте ссылку на SMP, предоставляя многоязычный плагин для обеспечения навигации на нескольких языках для отдельных лиц, чтобы подать заявку на участие в усилиях по отбору проб окружающей среды, ответив на вопросы, связанные с биобезопасностью, указанные в онлайн-форме.
Включите в раздел выборки графические и аудиовизуальные протоколы на английском и испанском языках. Визуализируйте геопространственные данные с помощью интерфейса геопространственного прикладного программирования, облегчаемого поставщиком облачных компьютерных услуг. Храните данные, отправленные в LIMS через SMP, чтобы облегчить централизованное хранение, отслеживание рабочих процессов обработки и управление логистикой.
Информация о предварительной загрузке, такая как идентификатор комплекта образцов, идентификатор образца, дата, время и координаты глобальной системы позиционирования, обеспечивает соответствие типам данных и сводит к минимуму ошибку. Включите ссылку запроса на получение образца для участников, которую они могут использовать после того, как они собрали все образцы. Создайте комплект, который содержит все материалы для отбора проб, включая необходимые средства индивидуальной защиты, такие как маска и перчатки, протокол отбора проб и информацию, относящуюся к биобезопасности.
Тампон редко дезинфицировал поверхности в домашних хозяйствах и городской среде, смачивая один сантиметр квадратного полиэфирового абсорбирующего тампона моющим средством и смазывая поверхность площадью 10 сантиметров в квадрате. С помощью зубочистки погрузьте каждый образец мазка в предварительно маркированную трубку, содержащую 200 микролитров тиоцианата гуанидиния. Наденьте предоставленную маску и новую пару перчаток для сбора каждого образца, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
После завершения отбора проб используйте предоставленное дезинфицирующее средство для рук. Храните трубки при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока они не будут доставлены в лабораторию. Как только образцы поступят в лабораторию, храните их при минус 80 градусах Цельсия.
Чтобы увеличить скорость скрининга, обработайте образцы в бассейнах. Если пул положительный, извлеките РНК каждого образца независимо. Объедините образцы из каждого набора для отбора проб в два бассейна, объединив 50 микролитров каждого из восьми образцов в микроцентрифужную трубку и сохранив оставшиеся образцы при минус 80 градусах Цельсия.
Добавьте 80 микролитров хлороформа и вихря в течение 15 секунд. Затем инкубировать в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Центрифуга в 13 000 раз G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.
Перенесите водный слой в новую микроцентрифужную трубку. Храните оставшуюся часть раздела и розовую жидкость в морозильной камере при минус 80 градусах Цельсия. Эти фракции содержат ДНК и белки.
Экстрагировать РНК из восстановленного водного слоя с использованием протокола экстракции РНК на основе гуанидиния тиоцианата. Приготовьте реакционную смесь RT-LAMP при комнатной температуре с избыточным объемом 10% для учета потерь при пипете. Добавьте пять микролитров РНК к реакции образца и пять микролитров РНК плюс 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к шиповидной реакции.
Добавьте 2,5 микролитра синтетической РНК SARS-CoV-2 к положительному контролю и пять микролитров воды к отрицательному контролю. Хорошо перемешайте и раскрутите реакции. Для колориметрического наблюдения отрицательный результат обозначается розовым цветом, а положительный результат обозначается желтым.
После RT-LAMP выполняют гель-электрофорез. Распределение образцов сайтов сбора показано здесь. Большинство комплектов были полными, и соответствующие данные были загружены в LIMS.
Предел обнаружения на частоте 100% составлял 500 копий на 25 микролитр реакции. В колориметрическом RT-LAMP положительные образцы изменили цвет с розового на желтый из-за сдвига рН с восьми до 5,5. При низких числах копий образцы были запущены на агарозном гелевом для подтверждения положительных результатов с результирующим лестничным рисунком.
Методы RT QPCR были опробованы на образцах окружающей среды. Все мастер-миксы были чувствительны к ингибиторам при низких концентрациях числа копий положительного контроля. При низких концентрациях шаблона традиционные методы ОТ-ПЦР показывали ложноположительные и ложноотрицательные результаты.
Наконец, метод, называемый усилением скользящего круга, обнаружил небольшие количества целевой последовательности. Тем не менее, он показал усиление зонда в отсутствие шаблона РНК. Крайне важно выпустить призыв к действию, который охватил бы все слои общества, чтобы выборка действительно представляла риск воздействия на всех членов этого сообщества.
Эта структура обнаруживает генетический материал SARS-CoV-2. Исследования для проверки вирусной жизнеспособности являются следующим шагом.
Обзор
В данной статье представлен рабочий процесс на основе гражданской науки для обнаружения SARS-CoV-2 на редко очищаемых городских поверхностях во время пандемии COVID-19. Протокол использует легкодоступные материалы и реагенты, что позволяет проводить масштабный отбор проб из окружающей среды и чувствительную детекцию вирусной РНК даже в условиях ограничений цепочки поставок. Данный подход разработан с учетом устойчивости к ингибиторам, часто встречающимся в экологических пробах, и может быть адаптирован для будущего эпидемиологического надзора за другими вирусами.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Экологическая вирология
- Надзор в области общественного здравоохранения
- Молекулярная диагностика
Теоретическая справка
- Передача SARS-CoV-2 через поверхности вызывала серьезную обеспокоенность в период пандемии COVID-19.
- Большинство мероприятий по экологическому мониторингу было сосредоточено на объектах с высокой распространенностью вируса, таких как больницы и общественный транспорт.
- Городские поверхности, которые редко подвергаются очистке, могут служить резервуарами вируса.
- Дефицит ресурсов во время пандемии потребовал разработки альтернативных стратегий отбора проб и детекции.
Цель исследования
- Разработать и валидировать рабочий процесс для обнаружения SARS-CoV-2 на редко дезинфицируемых городских поверхностях.
- Привлечь гражданских ученых к масштабному отбору проб из окружающей среды.
- Создать протокол, устойчивый к дефициту расходных материалов и наличию ингибиторов из окружающей среды.
Используемые методы
- Привлечение 350 гражданских ученых через местные и социальные сети с многоязычной поддержкой.
- Распределение наборов для отбора проб, содержащих СИЗ, тампоны и протоколы.
- Снятие мазков с поверхностей площадью 10 cm2 с использованием полиэстровых тампонов, смоченных в моющем средстве.
- Консервация образцов в гуанидинтиоцианате без необходимости соблюдения холодовой цепи.
- Объединение образцов в пулы для первичного скрининга с последующей индивидуальной экстракцией РНК при положительном результате анализа пула.
- Экстракция РНК с использованием протокола на основе гуанидинтиоцианата.
- Детекция с помощью колориметрического RT-LAMP с подтверждением методом гель-электрофореза.
- Сравнение с методами RT-qPCR и амплификацией по типу катящегося кольца.
- Централизованное управление данными с использованием лабораторной информационной системы (LIMS) и инструментов геопространственной визуализации.
Основные результаты
- Было собрано более 4 000 образцов с различных городских поверхностей.
- Метод RT-LAMP продемонстрировал предел обнаружения 500 копий на 25 µL реакционной смеси с четким колориметрическим считыванием результата.
- Объединение образцов в пулы повысило эффективность скрининга; положительные пулы подвергались деконволюции для индивидуального анализа.
- Метод RT-qPCR оказался чувствителен к ингибиторам при низком количестве копий, что приводило к ложноположительным или ложноотрицательным результатам.
- Амплификация по методу катящегося кольца показала неспецифическую амплификацию при отсутствии матрицы РНК.
- Разработанный рабочий процесс позволил успешно привлечь общественность и обеспечить комплексный экологический мониторинг.
Выводы
- Описанный протокол позволяет проводить высокочувствительное обнаружение РНК SARS-CoV-2 на городских поверхностях с использованием доступных материалов и при участии граждан.
- Данный рабочий процесс устойчив к воздействию экологических ингибиторов и может быть адаптирован для мониторинга вспышек других вирусов в будущем.
- Необходимы дальнейшие исследования для оценки жизнеспособности вирусов на обнаруженных поверхностях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Экологический мониторинг вирусной РНК на городских поверхностях представляет собой масштабируемую систему для раннего выявления рисков передачи инфекции в сообществе и обнаружения природных резервуаров. Данный рабочий процесс обеспечивает возможность быстрого распределенного отбора проб и надежного обнаружения даже в условиях ограничений в цепочках поставок, что повышает прогностическую уверенность в сфере общественного здравоохранения и биофармацевтических исследований и разработок. Этот подход может быть адаптирован для мониторинга будущих патогенов, что позволит оптимизировать оценку рисков и стратегии вмешательства на всех этапах — от открытия до эпидемиологического надзора.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Обеспечивает возможность проведения оценки резервуаров вируса в окружающей среде на основе выдвинутых гипотез, что имеет значение для динамики передачи.
- Способствует снижению биологических рисков путем уточнения наличия и распределения вирусной РНК на различных поверхностях.
- Повышает прогностическую достоверность моделей воздействия инфекционных агентов из окружающей среды.
Скрининг и разработка анализа
- Предоставляет валидированные протоколы высокочувствительного обнаружения вирусной РНК в сложных матрицах окружающей среды.
- Стандартизирует сбор и обработку образцов для получения воспроизводимых количественных результатов в крупных когортах.
- Демонстрирует устойчивость анализа к ингибиторам, что обеспечивает надежный скрининг в реальных условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Согласует данные экологического мониторинга со стратегиями использования биомаркеров общественного здравоохранения для подготовки к вспышкам заболеваний.
- Обеспечивает непрерывность процесса от обнаружения в окружающей среде до доклинического моделирования рисков и планирования вмешательств.
- Поддерживает развитие инструментов мониторинга новых патогенов с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Данный рабочий процесс объединяет экологический мониторинг, молекулярную диагностику и централизованное управление данными, что позволяет использовать его на всех этапах: от раннего обнаружения до трансляционного эпидемиологического надзора.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о передаче в окружающей среде и картирование резервуаров.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимое количественное определение вирусной РНК в объединенных и индивидуальных образцах.
- Аналитика: объединяет геопространственные данные и данные LIMS для сравнительного анализа и контроля соответствия.
- Трансляционные исследования: служат основой для согласования биомаркеров общественного здравоохранения и разработки стратегий реагирования на вспышки заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает масштабируемую и адаптивную платформу для будущих инициатив по эпиднадзору за патогенами.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность при оценке экологических рисков и валидации мишеней.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированный, масштабируемый отбор проб и детектирование в условиях ограниченных ресурсов.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о целесообразности развертывания систем эпиднадзора и приоритизации мероприятий.
- Влияние на портфель: Способствует приоритизации разработки инструментов надзора и диагностики с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области молекулярной диагностики и протоколов отбора проб из окружающей среды.
- Необходим доступ к базовой лабораторной инфраструктуре и LIMS для управления данными.
- Требуется межкомандная стандартизация сбора, обработки и отчетности по образцам.
- Метод адаптируем к различным городским и общественным условиям при минимальных требованиях к материальному обеспечению.
- Детекция ограничена вирусной РНК; необходимым следующим шагом являются исследования жизнеспособности.
