Автоматизированный протокол рассечения для обогащения опухоли в тканях с низким содержанием опухоли
29 марта 2021 г.
Цифровая аннотация с автоматизированным рассечением тканей обеспечивает инновационный подход к обогащению опухоли в случаях с низким содержанием опухоли и адаптируется как к парафиновым, так и к замороженным типам тканей. Описанный рабочий процесс повышает точность, воспроизводимость и пропускную способность и может применяться как к исследованиям, так и к клиническим условиям.
Выделение или обогащение небольших дисперсных областей, представляющих интерес, из FFPE или свежезамороженного материала может быть достигнуто с помощью автоматизированного рассечения быстрее и эффективнее, чем с помощью традиционных методов. Извлечение геномного материала из FFPE, или свежезамороженной ткани, является требованием для многих клинических и трансляционных исследовательских лабораторий. Автоматизированное рассечение заполняет значительный разрыв между макродиссекцией и микродиссекцией лазерного захвата.
Для начала аннотируйте отсканированные изображения слайдов для интересующих опухолевых областей, используя предоставленную поставщиком смотровую платформу или средство просмотра с открытым исходным кодом. Поместите незапятнанный слайд образца ткани на сцену в первом-четвертом положении слайда при использовании цифровой ссылки на слайд. Создайте задание фрезерования с помощью автоматизированного программного обеспечения для рассечения тканей, открыв список заданий, затем выберите Создать новое задание и введите идентификатор дела и имя, чтобы ввести имя задания.
Перейдите в раздел Толщина и выберите толщину секции с помощью вкладки со стрелкой вверх или вниз. Затем перейдите в раздел Подготовка тканей и выберите Парафинизированный или Депарафинизированный. Выберите Эталонное изображение"Из файла и Импорт изображения.
Затем выберите файл для импорта из раскрывающегося списка в качестве цифровой ссылки. Отсканируйте рабочую область, нажав кнопку «Этап сканирования» в правом нижнем углу, чтобы захватить каждый слайд образца ткани в первой-четвертой позиции. Для ссылки на рабочую область перетащите поле, чтобы создать прямоугольную область над тканью, и выберите круглый пузырь под прямоугольной областью, чтобы захватить эталонное изображение стадии.
Скопируйте это прямоугольное поле на оставшиеся слайды образца ткани во втором-четвертом положениях слайда, выбрав параметр копирования в правом верхнем углу эталонного изображения. Затем выровняйте и измените размер по мере необходимости. Для цифрового эталонного изображения наложите изображение на выбранную прямоугольную область.
Затем значительно измените размер и выровняйте цифровую ссылку, конечно, масштабируйте, чтобы наилучшим образом соответствовать размеру и положению над тканью образца. Скопируйте это прямоугольное поле на оставшиеся слайды образца ткани во втором-четвертом положениях слайда, выбрав параметр копирования в правом верхнем углу эталонного изображения. Затем выровняйте и измените размер по мере необходимости.
Нажмите кнопку «Этап сканирования» в правом нижнем углу, чтобы перейти к шагу тонкой настройки. Выберите положение первого этапа и значок инструмента «Трансформирование» на правой панели инструментов, чтобы выполнить точное выравнивание и корректировку масштаба ссылки в соответствии с примером наложения слайдов. Используйте ссылку на скользящую панель образца в нижней части экрана, переключаясь между эталонными и образцами изображений.
А также функция увеличения и уменьшения масштаба для настройки и достижения выравнивания каждого положения слайда. После достижения оптимального наложения образца нарисуйте обозначения контура фрезерования на цветной части маскированного эталонного изображения, выбрав значок инструмента палитры цветов на панели инструментов справа. Нарисуйте контуры фрезерования на образцах слайдов, нажав кнопку «Получить аннотации» в правом нижнем углу экрана.
Захватите и соберите интересующую аннотированную область с помощью четырех или менее фрезерных наконечников при расчете пути фрезерования. Использование фрезерного наконечника в левом верхнем углу рассчитывается на основе площади покрытия и выбранного размера наконечника. Размер наконечника может быть изменен под стрелкой фрезерного наконечника, и использование наконечника будет пересчитано.
Когда контур фрезерования выбран в первой позиции слайда, он будет скопирован в остальные позиции слайда. Нажмите кнопку «Этап настройки» в правом нижнем углу экрана для оперативной загрузки фрезерных наконечников из коллекторных трубок в их надлежащем обозначении на сцене. Заполните резервуар тремя миллилитрами соответствующего буфера рассечения для типа ткани и для последующей экстракции нуклеиновых кислот.
Затем нажмите кнопку «Рассекать» в правом нижнем углу экрана. После автоматического вскрытия извлеките из сцены сборные трубки и рассеченные слайды образцов. Поместите трубки для сбора в стойку для трубок, а слайды — в стойку для скольжения.
Окрашенный формалин H & E, встроенный фиксированный парафин и свежезамороженные участки печени мыши, содержащие метастатический колоректальный рак в ксенотрансплантатах, были отсканированы на целом слайд-тепловизоре с 20-кратным увеличением и использованы в качестве эталонных слайдов. Окрашенные H&E эталонные слайды были аннотированы и замаскированы в цифровом виде для опухолевых областей для рассечения и экстракции нуклеиновых кислот. Слайды образцов после вскрытия были окрашены H&E, чтобы подтвердить области рассечения на слайдах размером 10 микрометров и 20 микрометров.
Захваченные метрики продемонстрировали успех автоматизированной диссекции и экстракции нуклеиновых кислот. При попытке использовать этот протокол имейте в виду, что достижение относительно точного наложения аннотации на незапятнанные слайды важно для выделения областей, представляющих интерес.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол автоматизированного препарирования тканей для обогащения опухолевых зон в образцах с низким содержанием опухолевых клеток, что позволяет проводить высококачественную экстракцию нуклеиновых кислот для последующего применения, такого как полноэкзомное секвенирование. Данный метод основан на использовании цифровых аннотаций, накладываемых на неокрашенные стекла, что повышает точность, воспроизводимость и пропускную способность по сравнению с традиционной макродиссекцией и лазерной захватывающей микродиссекцией.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Молекулярная патология
- Технология диссекции тканей
- Геномный анализ
Теоретическая справка
- Ткани с низким содержанием опухоли (<20% опухолевых клеток) часто не дают достаточного количества материала для проведения надежных последующих анализов.
- Традиционная макродиссекция зависит от оператора и недостаточно точна, в то время как лазерная микродиссекция трудозатратна и дорога.
- Автоматизированная диссекция тканей предлагает решение путем сочетания цифровой аннотации с точным автоматизированным фрезерованием.
- Точное обогащение опухолевых зон имеет решающее значение для рабочих процессов клинического и исследовательского секвенирования.
Цель исследования
- Продемонстрировать протокол автоматизированного обогащения опухолевых участков в FFPE-блоках или свежезамороженных тканях.
- Повысить эффективность и воспроизводимость диссекции тканей для экстракции нуклеиновых кислот.
- Обеспечить получение высококачественных данных из образцов с низким содержанием опухолевых клеток для целей секвенирования.
Используемые методы
- Цифровая аннотация опухолевых областей на сканированных контрольных предметных стеклах, окрашенных гематоксилином и эозином (H&E), с использованием специализированного или открытого программного обеспечения.
- Наложение цифровых аннотаций на неокрашенные срезы тканей для точного нацеливания.
- Автоматизированное фрезерование аннотированных областей с использованием лезвия диаметром 250 µm2 на срезах тканей, зафиксированных в формалине и залитых парафином (FFPE), или свежезамороженных срезах толщиной до 20 µm.
- Сбор вырезанной ткани для экстракции нуклеиновых кислот и последующего полноэкзомного секвенирования.
Основные результаты
- Автоматизированная диссекция позволяет эффективно изолировать небольшие, рассредоточенные участки опухоли из тканей с низким содержанием опухолевых клеток.
- Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E) после диссекции подтверждает точность удаления аннотированных областей.
- Показатели сбора образцов свидетельствуют об успешном обогащении и экстракции нуклеиновых кислот.
- Данный протокол увеличивает пропускную способность и снижает расход предметных стекол по сравнению с ручными методами.
Выводы
- Автоматизированная диссекция тканей повышает точность и воспроизводимость обогащения опухолевым материалом в образцах с низким содержанием целевых клеток.
- Данный метод восполняет пробел между макродиссекцией и лазерной микродиссекцией.
- Он подходит как для клинического, так и для исследовательского применения, где требуются высококачественные нуклеиновые кислоты для секвенирования.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Автоматизированная диссекция для обогащения опухолевым материалом тканей с низким содержанием опухолевых клеток устраняет критическое узкое место в получении высококачественных нуклеиновых кислот для последующих геномных анализов. Снижая зависимость от действий оператора и увеличивая пропускную способность, данный протокол повышает прогностическую достоверность и воспроизводимость на стыке фундаментальных и трансляционных исследований. Его внедрение способствует принятию обоснованных решений с учетом рисков и развитию портфеля разработок в рамках научно-исследовательских программ в области онкологии.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает точную изоляцию опухолевых участков, что способствует достоверной валидации мишеней в гетерогенных образцах тканей.
- Снижает биологическую неоднозначность за счет повышения чистоты исходного материала для молекулярного анализа.
- Способствует уверенной проверке гипотез путем минимизации контаминации тканями, не являющимися опухолевыми.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать обогащенные образцы, подходящие для стандартных последующих анализов, таких как секвенирование следующего поколения.
- Повышает воспроизводимость анализа за счет автоматизации этапов отбора и препарирования тканей.
- Обеспечивает масштабируемость рабочих процессов за счет увеличения пропускной способности и сокращения использования предметных стекол.
Трансляционные и доклинические исследования
- Приводит подготовку образцов в соответствие с требованиями к поиску и валидации трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывность процесса от забора тканей до получения геномных данных в доклинических моделях.
- Снижает риски трансляционных исследований, обеспечивая подачу высококачественных нуклеиновых кислот с обогащением по опухолевым клеткам.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол автоматизированной диссекции применяется на этапе между получением ткани и экстракцией нуклеиновых кислот, обеспечивая надежную подготовку образцов для секвенирования и молекулярного профилирования как в исследовательских, так и в трансляционных рабочих процессах.
- Поисковая биология: Поддерживает исследования, основанные на гипотезах, обеспечивая точную изоляцию интересующих областей из сложных тканей.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимое количественное обогащение, подходящее для анализов с использованием высокопроизводительного секвенирования.
- Аналитика: Предоставляет метрики сбора и подтверждение после извлечения для проверки качества образца и успеха обогащения.
- Трансляционные исследования: Связывает доклиническую и клиническую обработку образцов с помощью стандартизированных масштабируемых методов обогащения.
- Корпоративное повторное использование: Предлагает платформонезависимую возможность, адаптируемую к различным типам тканей и исследовательским задачам.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неоднозначность в молекулярных анализах.
- Операционная ценность: стандартизирует обогащение тканей, повышая воспроизводимость и пропускную способность.
- Стратегическая ценность: позволяет принимать более обоснованные решения о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go) за счет обеспечения высокого качества исходного материала для последующих анализов.
- Влияние на портфель проектов: поддерживает приоритезацию с учетом рисков за счет снижения вариабельности образцов в геномных исследованиях.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с аннотированием в цифровой патологии и программным обеспечением для автоматизированной диссекции.
- Необходим доступ к совместимому оборудованию для визуализации, аннотирования и фрезерования.
- Для обеспечения воспроизводимости требуется межкомандная стандартизация параметров аннотирования и диссекции.
- Метод применим как к FFPE-образцам, так и к свежезамороженным тканям животного или человеческого происхождения.
- Оптимальное обогащение зависит от точности наложения и выравнивания цифровых аннотаций.
