Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам методом стимулированной рамановской рассеянной визуализации включения дейтерия в одну бактерию

Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам может быть получено в течение 2,5 часов в моче и крови, что считается огромным сокращением времени анализа по сравнению с обычным методом микроразбавления бульона. Он может контролировать метаболическую активность бактерий в сложной среде, такой как цельная кровь. Для начала проверьте концентрацию бактерий в образцах, измерив оптическую плотность фотометром на длине волны 600 нанометров.

Чтобы достичь конечной концентрации клеток в восемь раз в 10 раз до пятой колониеобразующей единицы, или КОЕ, на миллилитр, разбавьте бактериальный раствор, используя нормальную среду MHB без дейтерия. После смешивания бактериальных клеток вихрем удаляют 300 микролитровых аликвот бактериального раствора в семи 1,5-миллилитровых микротрубках и 600-микролитровую аликвоту бактериального раствора в одной 1,5-миллилитровой микропробирке. Затем добавляют 4,8 микролитра раствора антибиотика в микропробирку, содержащую 600 микролитров бактериального раствора, для достижения конечной концентрации антибиотика в восемь микрограммов на миллилитр.

Добавьте 300 микролитров бактериального раствора с антибиотиком к 300 микролитровой аликвоте бактериального раствора без антибиотика для получения двукратного разбавленного раствора с конечной концентрацией антибиотика четыре микрограмма на миллилитр. Повторяют двукратное серийное разведение исследуемых антибиотиков до тех пор, пока не будет достигнута самая низкая концентрация 0,25 мкг на миллилитр. Выбросьте 300 микролитров раствора из последней микропробирки.

Выделяют одну трубку без антибиотиков для положительного контроля при лечении дейтерием и отрицательного контроля без дейтерия. Инкубируют бактериальную аликвоту антибиотиком, содержащим MHB-среду, в течение одного часа. Тем временем готовят серийное разведение антибиотиков со 100% дейтерием, содержащим MHB-средой с теми же градиентами концентрации, что и описанные ранее.

После одного часа инкубации добавляют 700 микролитров антибиотика, последовательно разбавленного 100% дейтерием, содержащим MHB-средой, к 300 микролитрам предварительно обработанных антибиотиком бактерий в той же концентрации антибиотика. Гомогенизируйте смесь путем пипетки вверх и вниз несколько раз. Добавьте 700 микролитров 100% дейтерия, содержащего MHB-среду, к 300 микролитрам бактерий без антибиотиков в качестве положительного контроля.

Добавьте 700 микролитров безантибиотиков 0% дейтерия, содержащего MHB-среду, к 300 микролитрам бактерий без антибиотиков в качестве отрицательного контроля. Инкубируйте все микротрубки при 37 градусах Цельсия и 200 оборотах в минуту в течение 30 минут. После инкубации центрифугируют один миллилитр обработанного антибиотиком и дейтерием бактериального образца в 6, 200 раз в г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Затем дважды промыть гранулу очищенной водой. Зафиксируйте образцы в 10% объеме по объему раствора формалина и храните их при четырех градусах Цельсия. Проверьте концентрацию кишечной палочки в свежеприготовленном бактериальном образце, измерив оптическую плотность фотометром на длине волны 600 нанометров.

Чтобы имитировать клинические образцы инфекции мочевыводящих путей, увеличьте образец Escherichia coli на 10 миллилитров деидентифицированных образцов мочи, чтобы достичь конечной концентрации от 10 до шести КОЕ на миллилитр. Отфильтруйте шипованную мочу Escherichia coli с помощью пятимикронного фильтра и разделите отфильтрованный бактериальный раствор на 300 микролитровых аликвот на семь 1,5-миллилитровых микротрубок и 600-микролитровую аликвоту в одной микропробирке 1,5-миллилитра. Проводите лечение дейтерием в присутствии антибиотиков, как описано выше.

Чтобы имитировать образцы клинической инфекции кровотока, шип Pseudomonas aeruginosa в одном миллилитре деидентифицированной крови человека достигает конечной концентрации от 10 до шестого КОЕ на миллилитр. Для лизирования крови добавьте девять миллилитров стерильной очищенной воды. Фильтруйте Pseudomonas aeruginosa с шипованной кровью с помощью пятимикронного фильтра.

Затем собирают бактерии из отфильтрованного образца до объема в один миллилитр путем центрифугирования в 6, 200 раз в г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования разделите Шипованный раствор крови Pseudomonas aeruginosa на 300 микролитровых аликвот на семь 1,5-миллилитровых микротрубок и 600-микролитровую аликвоту бактериального раствора в одной 1,5-миллилитровой микропробирке и выполните лечение дейтерием в присутствии антибиотиков, как описано ранее. Для пробоподготовки промыть один миллилитр неподвижного раствора бактерий очищенной водой и центрифугировать промытый раствор бактерий в 6 200 г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Удалите супернатант и обогатите бактериальный раствор примерно до 20 микролитров стерилизованной водой. Нанесите бактериальный раствор на покрытое поли-L-лизином покровное стекло, сэндвич с другим покровным стеклом и запечатайте образец. В микроскопе SRS перестраиваемый фемтосекундный лазер с частотой повторения 80 мегагерц обеспечивает накачку и лазеры возбуждения Стокса.

Луч Стокса модулируется акустооптическим модулятором при 2,4 мегагерцах. Два луча колинейно объединены через дихроичное зеркало. Затем накачка и лучи Стокса направляются в лабораторный лазерный сканирующий микроскоп с зеркалом 2D Galvo для лазерного сканирования.

60-кратный водный объектив фокусирует лазеры на образце, а масляный конденсатор собирает сигнал от образца. Два фильтра используются для фильтрации луча Стокса, в то время как пучок насоса обнаруживается фотодиодом, после чего стимулируемый рамановский сигнал извлекается блокирующим усилителем. Используя управляющее программное обеспечение, введите и настройте длину волны насоса до 852 нанометров.

Отрегулируйте частоту вибрации от C до D до 2, 168 волнового числа для изображения бактерий с помощью микроскопа SRS. Измерьте мощность лазера с помощью измерителя мощности. Установите мощность накачки лазера на образце на восемь милливатт, а мощность лазера Стокса на образце на 50 милливатт, отрегулировав полуволновую пластину перед выходом лазера.

Поместите стандартный образец DMSO d6 на стадию образца и используйте объектив погружения в воду 60 раз, чтобы сфокусировать накачку и лазеры Стокса на образце. Регулируя винты зеркал отражения, пространственно выравнивайте накачку и лучи Стокса и направляйте два луча в вертикальный микроскоп, оснащенный зеркальной системой 2D Galvo для лазерного сканирования. На панели управления программным обеспечением установите для каждого изображения SRS значение 200 на 200 пикселей, а время выдержки пикселя на 30 микросекунд.

Общее время получения одного изображения составляет около 1,2 секунды. Установите размер шага на 150 нанометров, чтобы размер изображения составлял около 30 на 30 микрометров в квадрате. После оптимизации системы возьмите стандартный образец и поместите бактериальный образец на стадию образца под объективом погружения в воду 60 раз.

Начните SRS-визуализацию бактериальных образцов. Изображение не менее трех полей зрения для каждого образца. Влияние инкубационного времени на инкорпорацию дейтерия измеряется с помощью спонтанной рамановской микроспектроскопии в областях CD и CH.

График соотношения интенсивности CD к CH за время инкубации дейтерия для отдельных бактерий показал увеличение интенсивности CD над интенсивностью CH в течение времени инкубации от нуля до 180 минут. SRS-визуализация Pseudomonas aeruginosa проводилась при инкубации с гентамицином и 70% дейтерием. Дальнейший количественный статистический анализ показал, что сигналы CD бактерий были значительно ниже при двух микрограммах на миллилитр или выше концентрация гентамицина, чем без лечения гентамицином.

Порог интенсивности отсечения на уровне 0,60 пришел к выводу, что Pseudomonas aeruginosa метаболически ингибировалась при двух микрограммах на миллилитр и более высоких концентрациях гентамицина. SC-MIC для Pseudomonas aeruginosa против гентамицина в нормальной среде MHB было определено как два микрограмма на миллилитр, что находилось в пределах однократного диапазона разницы с MIC в четыре микрограмма на миллилитр, определяемого методом микроразбавления бульона. Быстрое тестирование чувствительности к противомикробным препаратам, или АСТ, образцов мочи с шипами Escherichia coli проводилось с помощью визуализации SRS.

SC-MIC для образца мочи с шипами Escherichia coli против амоксициллина был определен как четыре микрограмма на миллилитр, что имеет такое же считывание восприимчивости, как и MIC восьми микрограммов на миллилитр обычным методом разбавления бульона для чистой кишечной палочки в нормальной среде MHB. Применимость быстрого АСТ Pseudomonas aeruginosa, шипованная в крови человека, была исследована с помощью визуализации SRS. В интенсивности CD изображения SRS на уровне 2 168 на сантиметр преобладали бактериальные сигналы, исходящие от метаболического включения дейтерия живых бактерий.

SC-MIC для Pseudomonas aeruginosa в крови было определено как два микрограмма на миллилитр, что хорошо согласуется с обычным стандартным результатом MIC для Pseudomonas aeruginosa в нормальной питательной среде. Количество бактериальных клеток, используемое для тестирования чувствительности к противомикробным препаратам, поддерживается примерно в пять раз от 10 до пятой колониеобразующей единицы на миллилитр, как рекомендовано Институтом клинических и лабораторных стандартов. Более высокая концентрация бактерий может привести к увеличению минимальной ингибирующей концентрации.

Сочетание идентификации патогенов in situ и быстрой диагностики чувствительности к противомикробным препаратам может иметь большой потенциал для перевода в клинику, которая позволяет своевременно идентифицировать соответствующие антимикробные агенты для точного лечения.