Анализ микроокружения печени при раннем прогрессировании неалкогольной жировой болезни печени, связанной с гепатоцеллюлярной карциномой у рыбок данио

Здесь мы представляем, как создать модель рыбок данио, связанную с неалкогольной жировой болезнью печени (НАЖБП), связанную с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК), для изучения влияния избытка холестерина на микроокружение печени и иммунный клеточный ландшафт.

Наши модели и протокол рака печени рыбок данио предоставляют уникальную возможность визуализировать in vivo, неинвазивно, микроокружение печени и иммунный ландшафт с помощью прижизненной микроскопии. Прозрачность личинок рыбок данио, несомненно, является основным преимуществом этой системы, которая позволяет выполнять неинвазивную прижизненную микроскопию и получать представление о микроокружении и инфильтрации иммунных клеток глубокой ткани и органа, такого как печень. Наша нефротическая модель, вызванная диетой, и методы визуализации, описанные в этом протоколе, могут быть легко применены к запутанным клеточным взаимодействиям при других заболеваниях печени или областях исследований, включая метаболический синдром и сердечно-сосудистые заболевания.

Демонстрировать процедуру будут Кассия Майкл, наш лаборант, и доктор Франсиско Хуан Мартинес-Наварро, постдокторант в моей лаборатории. Для начала взвесьте четыре грамма коммерческого сухого корма для личинок рыбок данио в два стеклянных стакана по 25 миллилитров, один для нормальной диеты, а другой для диеты с высоким содержанием холестерина 10% или HCD. Взвесьте 0,4 грамма холестерина в 10-миллилитровом стеклянном стакане и накройте стакан фольгой.

В вытяжном шкафу измерьте пять миллилитров диэтилового эфира с помощью 10-миллилитрового шприца с иглой 20-го калибра. Затем добавьте диэтиловый эфир в обычный диетический стакан и сразу же смешайте его с сухим кормом с помощью шпателя. Измерьте еще пять миллилитров диэтилового эфира с помощью того же шприца и иглы и добавьте его в стакан, содержащий HCD.

Сразу же перемешайте, аспирируя вверх и вниз шприцем. Быстро добавьте раствор холестерина в стакан HCD и сразу же перемешайте его шпателем, пока раствор не станет однородным. Оставьте стаканы в вытяжке на срок до 24 часов, чтобы полностью испарить диэтиловый эфир.

На следующий день измельчите рацион на мелкие частицы с помощью пестика и ступки. Переложите каждую диету в небольшой полиэтиленовый пакет или 50-миллилитровую центрифужную трубку и храните их при минус 20 градусах Цельсия. Установите трансгенные рыбные линии на день минус один.

На нулевой день соберите икру в сетчатое ситечко после того, как рыба нерестится. Используя флакон для мытья с Е3, тщательно промойте яйца и аккуратно переложите их в 10-сантиметровую чашку Петри со средой Е3. Очистите пластины от всего мусора, который мог скопиться в гнездовых ящиках, включая любые мертвые или неоплодотворенные яйца, чтобы избежать неконтролируемого роста микроорганизмов и последующих дефектов развития личинок.

Затем разделите яйца на плотность 70 или 80 яиц на блюдо, содержащее 25 миллилитров Е3. В первый день проверьте и очистите мертвые эмбрионы или эмбрионы с дефектами развития под рассечением, оснащенным трансиллюминационной базой. На пятый день смешайте личинок со всех блюд в 15-сантиметровую чашку Петри и добавьте Е3 без метиленового синего. Разделите личинок в кормовых ящиках и кормите их так, как описано в тексте рукописи.

Держите личинок в комнате для рыбок данио или инкубаторе при температуре 28 градусов цельсия в темно-светлом цикле и кормите их два раза в день с 5 по 12 день. Ежедневно удаляйте остатки пищи, а также от 90 до 95% среды с помощью вакуумной системы, прикрепленной к наконечнику пипетки в один миллилитр. Затем осторожно налейте новый E3 без метиленового синего в один угол кормовой коробки, чтобы не повредить личинок.

Альтернативно, личинки могут быть разделены на трехлитровые резервуары с системной водой и размещены в качестве автономного системного блока с низким расходом воды. Эта альтернатива экономит время, необходимое для ежедневного процесса очистки, а система фильтрации помогает сохранить личинки здоровыми до конечной точки. На 13 день приготовьте блюда для сбора в соответствии с количеством экспериментальных условий, которые были установлены.

Налейте достаточно Е3 без метиленового синего, чтобы покрыть дно каждого блюда. Затем, осторожно, используя вакуумную систему, аспирировать воду из кормовых ящиков. Когда уровень воды начнет снижаться, медленно поднимите ящик для кормления, чтобы личинки подплыли к одному из углов, а затем аспирируют в обратном направлении.

Как только останется всего от 20 до 30 миллилитров жидкости, аккуратно засушите личинки в подготовленную чашку Петри и поместите меченую ленту из коробки для кормления на крышку чашки. На флуоресцентном стереомикроскопе экранируйте анестезированных личинок на наличие желаемых флуоресцентных маркеров. Затем добавьте трикаин Е3 в камеры ранящего и улавливающего устройства.

Удалите пузырьки воздуха из камер и удерживающего канала с помощью микропипетки P-200. Удалите все излишки трицина Е3, оставив только достаточный объем для заполнения камер. Затем перенесите обезболенные личинки в загрузочную камеру устройства ранения и захвата и позиционируйте его для визуализации левой доли с помощью инструмента для ресниц.

Изобразите морфологию всех необходимых клеток печени под конфокальным микроскопом, как описано в текстовой рукописи. Откройте программное обеспечение Fiji. Затем откройте файл изображения и установите флажок Разделить каналы на вкладке Параметры импорта биоформата.

После создания проекций максимальной интенсивности для каждого канала создайте ROI, окружающий личиночную печень, и измерьте область печени. Затем добавьте шкалу в качестве эталона и создайте вторую рентабельность инвестиций, включая область печени и 75 микрометров окружающей области. В меню Плагины выберите опцию Анализ, за которой следует Счетчик клеток, и подсчитайте иммунные клетки внутри области набора.

Запишите количество рекрутированных иммунных клеток в электронной таблице. Рассчитайте плотность нейтрофилов, макрофагов и Т-клеток путем нормализации количества иммунных клеток на площадь печени. Личинки рыбок данио HCC, питающиеся нормальной диетой, не показывают стеатоза печени, что измеряется окрашиванием Oil Red O.

Тем не менее, личинки ГЦК, питаемые HCD, показывают значительное увеличение стеатоза печени. После восьми дней воздействия избытка холестерина у личинок ГЦК наблюдалось увеличение печени. Для оценки гепатомегалии оценивали площадь печени, площадь поверхности печени и объем печени.

При неалкогольном стеатогепатит-ассоциированном ГЦК область гепатоцитов вместе с ядерной областью и соотношением ядер к цитоплазме были увеличены. Значительное снижение ядерной циркулярности наблюдалось также в группе с высоким содержанием жиров, получавших ГЦК. С помощью маркера H2B-mCherry было обнаружено большее количество микроядер у личинок ГЦК, которых кормили HCD.

Оценка сосудистой системы печени показала значительное увеличение плотности сосудов у личинок ГЦК, питаемых HCD. Инфильтрация макрофагов и нейтрофилов происходила как в ГЦК, так и в ГЦК, питавшихся личинками HCD. Количественная оценка нейтрофилов в макрофагах в печени и ее окрестностях показала значительное увеличение количества и плотности клеток в личинках ГЦК, питаемых ГХД.

Напротив, значительное снижение плотности Т-клеток в общем количестве наблюдалось у личинок ГЦК, питавшихся HCD. Очистка резервуаров и кормление являются наиболее важными шагами для обеспечения жизнеспособности личинок и предотвращения развития стеатоза или печени и системного хронического воспаления в контроле из-за плохого качества воды или неправильного кормления. Могут быть выполнены другие методы, такие как покадровая микроскопия и анализ взаимодействия между различными клетками, населяющими печень.

Кроме того, одноклеточный РНК-поиск рассеченной печени на разных стадиях рака печени может быть выполнен, чтобы полностью понять, как иммунный ландшафт печени развивается с прогрессированием заболевания.