Анализ молекулярной пружинной константы с помощью зондовой спектроскопии биомембранных сил
20 ноября 2021 г.
Биомембранный силовой зонд (BFP) - это метод динамической силовой спектроскопии in situ (DFS). BFP может быть использован для измерения пружинной постоянной молекулярных взаимодействий на живых клетках. Этот протокол представляет весенний постоянный анализ молекулярных связей, обнаруженных BFP.
В этом видео описываются пошаговые процедуры использования биомембранного силового зонда или BFP для измерения константы молекулярной пружины. В силовом зонде BFP недавно появился на поверхности нативной клетки или в анализе SITU Dynamic Force Spectroscopy. Основной целью этого метода является измерение генетики связывания одной молекулы.
Эта процедура анализа данных является простым, но мощным сообщением и предоставляет механическую информацию, в частности динамическую силу и воспаление молекул, экспрессивиющих клеточную мембрану. Во время цикла эксперимента BFP зондовый микробиом, соединяющийся с эритроцитами и завещанием, клеткой-мишенью и молекулярной связью рецептора лиганда между зондом и мишенью, может рассматриваться как последовательно связанная система мозга. Исходя из закона Гука, обратная полная константа пружины последовательной связанной пружинной системы равна сумме константы обратной пружины каждого отдельного компонента, как показывает уравнение.
Пружинная постоянная эритроцитов рассчитывается на основе событий движения, которое зависит от радиальной микропипетки зонда в отверстии. Эритроцит, круговая область контакта между эритроцитом и завещанием и аспирирующим давлением микропипетки. Дорожные данные BFP получают самодельный виртуальный прибор левого вида, который управляет движением целевой микропипетки с помощью переводчика PAs.
Полный сенсорный цикл PFP состоит из пяти этапов. Подход.Импейз.Контакт. Втягивай и диссоциировать. В начале, делается ли ударение, положение Robusto APICS обозначается как X равно 0 в черном дештине.
Затем цель приводится в движение куском или транслятором, чтобы втихнуть и сжать робусто, чтобы вызвать отрицательное движение завещания. Вы отмечаете его как X меньше нуля в красной линии тире. На стадии втягивления верхушка красного шины перемещается из положения X меньше нуля обратно в положение X, равное нулевому положению, называемому фазой сжатия.
Если между комплексом молекул рецепторов лиганда образуется связь, эритроцит будет еще больше отличаться от другого положительного направления. Этот X больше нулевого периода называется фазой растязания стадии втягивки. Стадия втягивания является наиболее важной частью для определения пружинной константы молекулы связи.
Собирайте данные о силе и времени с помощью платформы сбора данных BSP. Каждый эксперимент обычно записывает от 50 до 200 сенсорных циклов, откройте программное обеспечение для анализа данных PFP. Нажмите на желтый значок папки и выберите соответствующий файл данных строки, дважды щелкнув по ним.
Мы в программе. Затем нажмите на кнопки со стрелками вверх и вниз, чтобы переключаться между событиями. Использование критериев исключения выбросов для отсеировки недопустимых событий.
Выберите экспортируемый тип данных, который принудительно форматируется по времени, и выберите соответствующий диапазон времени состояния. Нажмите на кнопку экспортировать данные графика. Экспортированные данные сохраняются в виде текстового файла по умолчанию.
Этот текстовый файл содержит два столбца данных. Это первый столбец, представляющий временных пап, и второй столбец, представляющий соответствующую силу в каждой точке времени. Постройте кривую силы и времени с помощью программного обеспечения электронных таблиц для получения кривой принудительного и смещения.
Умножьте временное значение каждой точки данных на движение PSO Willow Steel. Обнульте первую точку данных, вычитая наименьшее значение смещения из каждой точки данных. Это горизонтальное преобразование не влияет на последующее вычисление пружинной константы.
В кривой «сила против смещения» две различные группы актора были разными, если можно было идентифицировать новый наклон силы. Каждый из них представляет фазу сжатия и фазу стиля 10. Подгонка строки регрессии к каждой группе данных.
Линия с более крутым уклоном представляет собой общую константу пружины на фазе компрессора, обозначенную как K1. И линия, которая была самой маленькой вершиной, представляет линию на этой фазе стиля 10, обозначенную как K2.As я уже упоминал, общая константа пружины является обратной от сына последовательной пружинной константы каждого компонента. Во время сжимающей фазы вхожения в клеточный режим молекулярная связь не растягивается, поэтому константа пружины молекулярной связи не принимается во внимание. Пружинная константа целевой ячейки описывается как уравнение, отображаемое там, где K1 представляет собой общую константу пружины во время фазы компрессора.
В фазе 10 стиля ритма для продажи, общая константа пружины является солнцем уверсной пружинной константы молекулярной связи красных кровяных клеток. А в клетке-мишени используйте отображаемое уравнение для вычисления константы пружины связи молекулера, которая K2 представляет собой общую константу пружины. Вы читаете фазу 10 остановок.
В режиме beat to beat, поскольку деформация B незначительна, термин, который описывает обратную константу пружины целевой клетки, приближается к нулю, поэтому полная константа пружины в фазе компрессора эквивалентна константе пружины эритроцитов, показанной в виде следующего уравнения. В фазе растяживания пружинная константа молекулярной связи может быть рассчитана путем вычитания эффекта эритроцита, показанного в следующем уравнении. Соберите пружинные константы интегрировательного положения бокового ветра B, комплекса Бета 3, ячейки K562 и комплекса интегрировательного отношения B Бета три, рассчитайте среднее и стандартное отклонение производных констант пружины по шкале Ньютона или нанометра.
Теперь вы должны лучше понять, каковы требования к измерению и пружинной константе из данных VFD. Следует заметить различия между режимом beat to cell и режимом beat to beat. Различные молекулы, представляющие службу, будут иметь разную защиту от меры постоянной пружины.
В заключение, эта пошаговая процедура описывает, как выполнить анализ молекулярной пружинной константы с использованием BFP. Мы предполагаем, что в будущем будут предприняты усилия по автоматизации и интеграции сбора данных BFP и анализа DFS в одну компьютерную программу отдыха. Сделать весь анализ данных операции BFP более удобным для пользователя и высоким во всем.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Biomembrane Force Probe (BFP) — это метод динамики сил, используемый для измерения коэффициента жесткости молекулярных взаимодействий на живых клетках. Этот протокол описывает анализ коэффициентов жесткости для молекулярных связей, обнаруженных с помощью BFP.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Динамическая спектроскопия сил
- Молекулярные взаимодействия
- Механика клеточной мембраны
Предисловие
- Техника BFP измеряет связывание одиночных молекул.
- Она предоставляет механическую информацию о клеточных мембранах.
- Анализ основан на законе Гука.
- Это включает взаимодействия между зондами и целевыми клетками.
Цель исследования
- Измерить молекулярные коэффициенты жесткости.
- Анализировать динамику молекулярных связей.
- Улучшить понимание взаимодействий клеточной мембраны.
Используемые методы
- Использование Biomembrane Force Probe (BFP).
- Анализ динамики сил in situ.
- Анализ данных молекулярных взаимодействий.
- Применение закона Гука для расчета коэффициента жесткости.
Основные результаты
- Успешное измерение молекулярных коэффициентов жесткости.
- Обзор динамики молекулярных связей.
- Демонстрация эффективности BFP в анализе живых клеток.
- Подтверждение теоретических моделей с помощью экспериментальных данных.
Выводы
- BFP является мощным инструментом для изучения молекулярных взаимодействий.
- Техника улучшает наше понимание механики клеток.
- Будущие приложения могут включать более широкие биологические исследования.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Measuring molecular spring constants via biomembrane force probe spectroscopy provides quantitative mechanical insights into ligand-receptor interactions, supporting target validation by characterizing bond stability and conformational dynamics. This approach enables mechanistic de-risking in early discovery by linking molecular mechanics to functional signaling, informing go/no-go decisions before compound screening. The method enhances predictive confidence in target selection by revealing force-dependent binding behaviors that correlate with physiological mechanosensing pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying bond stiffness and rupture forces under physiological loading rates.
- Operational Value: Enables direct comparison of molecular variants or mutants to identify stabilizing mutations that prolong bond lifetime.
- Scientific Value: Clarifies force-dependent conformational changes in receptors, supporting allosteric mechanism validation.
- Operational Value: Provides benchmark data for structure-guided design of therapeutics with optimized mechanical resilience.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates force-displacement curves that serve as orthogonal readouts for binding affinity in assay triage.
- Operational Value: Standardizes spring constant measurements across replicates using outlier exclusion criteria and regression fitting.
- Scientific Value: Distinguishes specific from nonspecific interactions based on tensile phase slope characteristics in bead-bead mode.
- Operational Value: Enables high-throughput collection of 50-200 touch cycles per experiment for robust statistical analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects molecular spring constants to cellular mechanosensing outputs, informing pathophysiological relevance in disease models.
- Operational Value: Supports continuity from purified systems to native cell surfaces via bead-cell and bead-bead modes.
- Scientific Value: Measures cell contribution to total spring constant, deconvolving target-specific molecular mechanics from probe or cell artifacts.
- Operational Value: Facilitates cross-platform comparison of molecular mechanics using standardized Hooke's law-based analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing mechanical phenotyping of targets after initial binding confirmation but before large-scale screening, helping prioritize targets with favorable force-stability profiles.
- Discovery Biology: Tests target hypothesis by measuring how molecular bonds respond to mechanical perturbation, revealing catch-bond or slip-bond behavior.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible spring constant outputs that enable rank-ordering of ligand variants or therapeutic candidates.
- Analytics: Employs linear regression on force-displacement data to derive spring constants (K1, K2) from compressive and tensile phases, enabling condition comparison.
- Translational Research: Links molecular mechanics to cell-scale responses by measuring target cell contribution in bead-cell mode, supporting mechanistic continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable nanotool for mechanical phenotyping across diverse receptor-ligand systems, reducing revalidation effort in follow-up campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct, quantitative measures of bond elasticity and force-dependent kinetics.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized data acquisition, outlier filtering, and exportable force-time datasets for external validation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying mechanically fragile targets early, reducing investment in high-risk pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on bond stability metrics, complementing traditional affinity and selectivity data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in dynamic force spectroscopy, micropipette manipulation, and force calibration using red blood cell standards.
- Depends on custom-built BFP setup with piezoelectric translators and homemade virtual instrumentation for precise displacement control.
- Necessitates cross-team standardization of outlier criteria, time-range selection, and regression fitting protocols across sites.
- Involves adaptation considerations when transitioning from bead-cell to bead-bead mode to isolate molecular contributions from cellular mechanics.
- Limited by the need for stable molecular tethering and functional ligand-receptor expression on probe or target surfaces to avoid artifactual signals.
