Анализ ограничения SAMHD1 с помощью проточной цитометрии в миелоидных клетках человека U937

С ростом интереса к роли клеточных факторов в ВИЧ-инфекции макрофагов мы разработали гибкую систему анализа, особенно для SAM HG, которая не экспрессируется в клетках U937. Основным преимуществом системы является ее гибкость. Как только он настроен, его можно использовать для анализа различных белков, клеток или вирусов-мишеней.

Важно поддерживать здоровье клеток, а также чувствовать себя комфортно с многоцветной проточной цитометрией. Включите цитометр и компьютер за 10 минут до начала анализа. Убедитесь, что отходы пусты, а резервуар для оболочки заполнен.

Затем войдите в систему и откройте программное обеспечение для анализа. После перемещения руки снимите водяную трубку. Установите высокий расход и нажмите прайм.

Подождите, пока погаснет свет, и повторите этот процесс еще три раза. Поместите водяную трубку обратно и работайте с высокой скоростью потока в течение трех минут. Затем установите низкий расход и нажмите режим ожидания до получения.

Выберите эксперимент, новый эксперимент и нажмите OK, чтобы выбрать пустой эксперимент, щелкните правой кнопкой мыши эксперимент и добавьте новый образец. Нажмите ok на пустой панели. Щелкните правой кнопкой мыши, чтобы переименовать с соответствующим именем и открыть образец, щелкнув знак плюс, чтобы открыть новую трубку.

Дважды щелкните по трубке, чтобы увидеть настройки цитометра в инспекторе. В меню параметров удалите ненужные фторхромы, кроме синего лазера 53030 и желтого лазера 61020. На листе создайте прямую точечную диаграмму области рассеяния и точечную диаграмму области рассеяния, гистограмму YFP, гистограмму RFP и точечную диаграмму RFP против YFP, щелкнув соответствующий значок и изменив оси, щелкнув метку оси.

Загрузите незараженный, непередаваемый элемент управления и нажмите кнопку запуска на машине. Затем нажмите кнопку acquire на панели мониторинга приобретения. Отрегулируйте прямое и боковое напряжение рассеяния на приборной панели, чтобы расположить ячейки в нижнем левом квадранте.

Ворота вокруг этой популяции и обозначьте ее как P one. Щелкните правой кнопкой мыши на других участках и выберите показать P один, чтобы удалить обломки из последующего анализа. Отрегулируйте напряжение RFP и YFP вниз, чтобы пик находился слева от гистограммы.

Загрузите одноцветный элемент управления для YFP и нажмите кнопку получения. Отрегулируйте напряжение YFP на приборной панели таким образом, чтобы наибольшее количество флуоресцентных ячеек находилось в пределах диапазона детектора. Затем повторите то же самое для элемента управления RFP.

Выберите эксперимент. Перейдите в настройку компенсации и выберите Создать элементы управления компенсацией и ОККО, чтобы переключиться на обычный лист, а затем выберите неиспорченный нормальный лист. Нажмите на ходу и приобретите незапятнанный элемент управления.

Нарисуйте ворота P вокруг неповрежденных ячеек и запишите. Снимите трубку и переведите машину в режим ожидания. Щелкните правой кнопкой мыши на P one.

Нажмите кнопку «Применить ко всем элементам управления компенсацией» и переключитесь на обычный рабочий лист RFP. Нажмите кнопку запуска и запишите одноцветный элемент управления RFP, и программное обеспечение автоматически зарегистрирует положительные ячейки. Переведите устройство в режим ожидания и повторите то же самое для управления YFP.

Выберите эксперимент, перейдите в настройку компенсации, выберите рассчитать компенсацию, а затем нажмите на ссылку и сохраните. Переключитесь на глобальный рабочий лист и вернитесь к образцу трубки. Приобретите клетки, трансдуцированные диким типом SAM HD, инфицированного ВИЧ RFP, и проверьте, что четыре различные популяции можно увидеть в углах квадрантов, выровненных вертикально и горизонтально для YFP и RFP.

Снимите трубку и нажмите режим ожидания. Перезагрузите непереведенный, незараженный образец и нажмите кнопку запуска. На панели мониторинга приобретения установите для остановочного шлюза значение P one и события для записи 30 000 событий.

Нажмите запись. Повторите то же самое для других образцов и элементов управления, нажав следующую трубку между каждой трубкой. Переименуйте образцы во время выполнения или после hawk и экспортируйте данные в виде точечных ФАЙЛОВ FCS.

Откройте программное обеспечение и перетащите все файлы FCS на панель мониторинга. Выберите элементы управления компенсацией и перетащите их в подпапку компенсации. Дважды щелкните по непереведенной, неинфицированной трубке, чтобы открыть файл и разбросать диаграмму вперед по сравнению со стороной.

Выделите инструмент «Полигон» и затвор на неповрежденной популяции ячеек, исключая мусор, в левом нижнем углу и назовите его ячейками. Переместите метку, чтобы она не заслоняла ячейки. Перетащите эти ворота на всю совокупность трубок в полосе всех образцов.

Прокрутите всю популяцию с помощью горизонтальных кнопок со стрелками, чтобы обеспечить соответствующую решетку для каждой трубки. Дважды щелкните по ячейкам и отрегулируйте оси по высоте и площади. Выберите одинарную большую популяцию, используя прямоугольные ворота, чтобы исключить дублеты и позволить программному обеспечению автоматически назвать ее одиночными ячейками.

Затем перетащите эти ворота ко всем популяциям клеток и убедитесь, что затвор подходит для всех образцов. Выберите популяцию одиночных клеток для неинфицированного, непереведенного образца. Измените ось Y на компенсированный синий лазер для оси YFP и оси X на компенсированный желтый лазер для RFP.

Выберите инструмент квадрантного захвата и щелкните в правом верхнем углу отрицательной популяции клеток. Примените это предварительное измерение ко всем популяциям одиночных клеток, перетащив его на родительский затвор на панели всех образцов. Если затворы квадранта не разделяют популяцию удовлетворительно, закройте отдельные квадранты с помощью инструмента полигона.

Прокрутите до дикого типа SAM HD один единственный образец, чтобы проверить правильность разрыва между непереведенными отрицательными и YFP положительными клетками. Используйте контурное представление, чтобы отличить отрицательные клетки от тусклых клеток YFP. Используйте лучшее деление между отрицательным и положительным YFP, которое справедливо для всех образцов, и прокрутите образцы, чтобы проверить решетку на предмет позитивности YFP.

Прокрутите до нетрансдуцированного образца, инфицированного ВИЧ RFP, и проверьте, является ли правильным разрыв между неинфицированным ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ RFP и инфицированным RFP-положительным. При необходимости используйте контурное представление и прокрутите оставшиеся образцы, чтобы убедиться, что затвор действителен для всех образцов. Для каждого образца требуется четыре квадранта.

Q1 YFP положительный, Q2 двойной положительный, Q3 RFP положительный и Q4 двойной отрицательный. Откройте редактор таблиц и перетащите четыре вешалки квадранта на панель мониторинга. Выберите файл и excel из раскрывающегося списка.

Выберите место назначения файла и нажмите на создать таблицу. Сохраните созданную электронную таблицу в соответствии с локальными соглашениями об именах файлов. Нажмите на значок редактора макета, чтобы экспортировать представления графиков и стратегий гатинга.

Выберите каждую популяцию и перетащите ее в редактор с необходимыми осями, метками и интервалами. Чтобы создать макет с одинаковыми графиками, показанными для всех образцов в пакетном разделе, введите один в столбец и нажмите создать пакетный отчет. В меню файла выберите масштаб по ширине и избегайте разрывов страниц.

Затем сохраните файл в требуемом формате. В экспортированной электронной таблице создайте столбцы, как описано в текстовой рукописи. Используйте соответствующее программное обеспечение для анализа данных, чтобы усреднить реплицированные данные для каждой конструкции SAM HD и рассчитать значения коэффициента ограничения.

Репрезентативные графики YFP и RFP были сгенерированы для получения оптимальных и неоптимальных данных. График неоптимальных данных показывает, что ВИЧ-инфекция была слишком низкой и создавала трудности с компенсацией и хранением. Коэффициент ограничения составил 0,5, что выше ожидаемого коэффициента 0,3.

Для оптимальных и неоптимальных данных сгенерированы графики коэффициента ограничения для вариантов SAM HD one по отношению к дикому типу и отрицательному контролю. В оптимальных данных дикий тип показал ожидаемое ограничение примерно 0,2, а отрицательный контроль HD 206 до семи AA имел коэффициент ограничения 1,0. Вариант R372D существенно отличался от дикого типа, но существенно не отличался от отрицательного контроля и утратил способность к ограничению.

В субоптимальных данных отрицательный контроль вел себя так, как ожидалось, но дикий тип показал коэффициент ограничения 0,5 из-за низкого уровня заражения. R143D показал промежуточный фенотип, статистически отличающийся от дикого типа и отрицательного контроля. Вариант G209S существенно отличался от дикого типа, но существенно не отличался от отрицательного контроля и, таким образом, утратил способность к ограничению.

Важно иметь много контрольных клеток, особенно если вы новичок в проточной цитометрии. Следуя этому или параллельно, можно проводить биохимический анализ одних и тех же мутантов для формирования целостной картины.