Высокопроизводительный анализ активности на основе ферментов для исследования взаимодействия малых молекул с дНТФазой SAMHD1
16 апреля 2021 г.
SAMHD1 представляет собой дезоксинуклеозидтрифосфаттрифосфогидролазу, играющую важнейшую роль в здоровье и болезнях человека. Здесь мы представляем универсальный анализ активности SAMHD1 на основе ферментов, развернутый в формате 384-луночного микропланшета, который позволяет оценивать малые молекулы и аналоги нуклеотидов в качестве субстратов, активаторов и ингибиторов SAMHD1.
Этот метод позволяет охарактеризовать, какие химиотерапевтические препараты гидролизуются SAMHD1 и может быть использован в качестве скринингового анализа для выявления низкомолекулярных ингибиторов этого фермента. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он прост, недорог и дает огромное количество информации о том, как различные малые молекулы взаимодействуют с этим ферментом. Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Мириам, постдок из группы.
Для начала подготовьте полный реакционный буфер SAMHD1, добавив Tween-20 и TCEP к конечным концентрациям 0,005% и 0,3 миллимоляра соответственно. Приготовьте стоп-раствор ЭДТА, добавив ЭДТА до конечной концентрации 7,9 миллимоляра в полном реакционном буфере SAMHD1. Приготовьте малахитовый зеленый, или рабочий раствор МГ, смешав 10 частей маточного раствора МГ с 2,5 частями 7%-ного молибдата аммония и 0,2 частями 11%-ного твин-20.
С помощью многоканальной пипетки последовательно разбавляйте испытуемые соединения в соответствующем растворителе до концентрации, в 100 раз превышающей конечную конечную концентрацию, в прозрачной полипропиленовой пластине с круглым дном на 96 лунок. далее разбавляют эти соединения до 25-кратной конечной концентрации с помощью полного реакционного буфера SAMHD1 для поддержания конечной концентрации растворителя ниже 1%Перелейте пять микролитров разбавленного компонента в соответствующие лунки прозрачной 384-луночной плоскодонной пробирной планшета и повторите процедуру с контрольными образцами, содержащими только растворители. Для приготовления ферментной мастер-смеси разбавьте рекомбинантный человеческий белок SAMHD1 и рекомбинантную пирофосфатазу в полном реакционном буфере SAMHD1 до четырехкратной желаемой конечной концентрации.
Приготовьте активатор или субстрат dGTP, разбавив раствор в полном реакционном буфере SAMHD1 до достижения концентрации 50 микромоляров. В лунки, содержащие разбавления соединений и контроль только растворителей, дозируют пять микролитров мастер-смеси пирофосфатазы SAMHD1, а в лунки без контроля ферментов добавляют пять микролитров полного реакционного буфера SAMHD1. Затем дозируют 10 микролитров раствора dGDP во все лунки для запуска реакции и инкубируют в течение 20 минут при комнатной температуре.
Чтобы остановить реакцию, добавьте 20 микролитров стоп-раствора ЭДТА. После добавления 10 микролитров рабочего раствора MG во все лунки перемешайте содержимое с помощью орбитального встряхивателя микролунок и центрифугируйте планшет при 1000 x g в течение одной минуты. Инкубируйте планшет в течение 20 минут при комнатной температуре и считывайте поглощение на длине волны 630 нанометров в планшетном считывателе с микролунками.
Вычислите среднеквадратическое отклонение положительных контрольных скважин, а затем вычислите среднее значение. Аналогично для скважин с отрицательным контролем рассчитайте стандартное отклонение, а затем вычислите среднее значение. Расчет Z-фактора является показателем качества пробы.
Нормализуйте каждое значение поглощения к средним значениям положительного и отрицательного контроля. Установка положительного элемента управления как 100%SAMHD1 активности, а отрицательного элемента управления как 0%SAMHD1 активности. График активности SAMHD1 зависит от концентрации соединения и соответствует четырехпараметрической кривой дозового отклика с переменным наклоном, позволяющей определить половину максимальной ингибирующей концентрации соединения.
Разбавьте нуклеотидные аналоговые запасы и полный реакционный буфер SAMHD1 до четырехкратной конечной концентрации и перелейте пять микролитров в соответствующие лунки 384-луночного планшета. Чтобы приготовить фермент SAMHD1 или мастер-смесь пирофосфатазы, разбавьте рекомбинантный человеческий белок SAMHD1 и пирофосфатазу Escherichia coli в полном реакционном буфере SAMHD1 до удвоенной конечной концентрации, превышающей желаемую конечную концентрацию. Готовят только раствор пирофосфатазы, разбавляя рекомбинантную пирофосфатазу Escherichia coli до удвоенной желаемой конечной концентрации в полном реакционном буфере SAMHD1.
Аналогичным образом приготовьте активаторы GTP и dGTP alpha S, разбавив сырье в полном реакционном буфере SAMHD1 до концентрации, в четыре раза превышающей конечную. Распределите пять микролитров активатора, GDP или dGTP alpha S, или полный реакционный буфер SAMHD1 в соответствующие лунки 384-луночного планшета, содержащего аналоги нуклеотидов. Начните реакцию, дозировав 10 микролитров мастер-смеси для пирофосфатазы SAMHD1, только пирофосфатазы или полного реакционного буфера SAMHD1 в соответствующие лунки и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
После остановки реакции с помощью стоп-раствора ЭДТА добавьте во все лунки 10 микролитров рабочего раствора МГ. После того, как содержимое будет перемешано, центрифугируйте планшет при 1000 x g в течение одной минуты и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре. Затем измерьте поглощение на длине волны 630 нанометров.
Рассчитайте средние значения поглощения пирофосфатазы только для реакционных ям, которые будут являться фоновым значением. Затем вычитают фоновое значение из соответствующих лунок в реакциях SAMHD1 или пирофосфатазы. Наконец, постройте график скорректированных значений поглощения для каждого аналога нуклеотида с буферными условиями GTP и dGTP alpha S.
В настоящем исследовании абсорбент увеличивался с увеличением концентрации фосфата натрия после инкубации с малахитовым зеленым реагентом и достигал насыщения при концентрации 0,25 миллимоляра. Линейный диапазон обнаружения фосфатов виден от 0,004 до 0,03 миллимоляра. Проиллюстрировано требование к компонентам анализа для достижения измеримой активности SAMHD1.
Ни SAMHD1, ни пирофосфатаза сами по себе не могут генерировать органический фосфат в присутствии dGTP. Однако при наличии всех компонентов анализа наблюдалось увеличение сигнала. Кривые дозового отклика, полученные для соединений-ингибиторов SAMHD1, показали, что увеличение концентрации эффективно ингибирует активность SAMHD1.
Гидроксимочевина не ингибирует активность SAMHD1 in vitro, на что указывала неизмененная активность SAMHD1 при увеличении дозы гидроксимочевины. Связывание dGTP с обоими аллостерическими сайтами активирует SAMHD1, обеспечивая последующий гидролиз этого нуклеотида, в то время как три других канонических dNTP сначала требуют активации GTP первого аллостерического сайта, прежде чем они смогут связать второй аллостерический сайт, а затем гидролизоваться в каталитическом центре. Для нуклеотидных аналогов клофарабинтрифосфат является аллостерическим активатором второго сайта и субстратом, так как активность наблюдается в присутствии ГТФ.
В то время как цитарабин трифосфат способен занимать только каталитический сайт, так как dGTP альфа S необходим для наблюдения за активностью. Активности с гемцитабина трифосфатом не наблюдалось. После идентификации малых молекул, ингибирующих SAMHD1 в этом анализе, с помощью физических подходов, таких как анализ теплового сдвига, можно использовать для исследования взаимодействия с мишенью.
Показанный здесь метод помог нам понять, какие из противораковых препаратов могут быть гидролизованы SAMHD1, и установить этот фермент в качестве потенциальной терапевтической мишени для преодоления лекарственной устойчивости.
Обзор
В данной статье представлен надежный высокопроизводительный метод анализа с использованием малахитового зеленого и ферментативного сопряжения для характеристики активности и ингибирования белка 1, содержащего стерильный альфа-мотив и HD-домен (SAMHD1). Метод позволяет проводить косвенное измерение активности SAMHD1 путем количественного определения неорганического фосфата, высвобождающегося при гидролизе нуклеотидов, что облегчает изучение взаимодействия этого фермента с малыми молекулами, включая ингибиторы и аллостерические регуляторы.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биохимия
- Энзимология
- Фармакология рака
Теоретическая часть
- SAMHD1 регулирует внутриклеточные пулы дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), гидролизуя dNTP.
- Этот белок участвует в метаболизме нуклеотидов, развитии резистентности к терапии и различных патологиях.
- Понимание регуляции и функций SAMHD1 имеет решающее значение для разработки терапевтических средств.
- Для исследования взаимодействия малых молекул с SAMHD1 необходимы простые высокопроизводительные методы анализа.
Цель исследования
- Разработать и продемонстрировать простой, недорогой и высокопроизводительный метод анализа активности SAMHD1.
- Охарактеризовать известные ингибиторы и субстраты SAMHD1, включая противоопухолевые препараты.
- Выяснить механизмы катализа SAMHD1 и его регуляции аллостерическими активаторами.
Используемые методы
- Приготовление реакционного буфера для SAMHD1, стоп-раствора ЭДТА и рабочего раствора малахитового зеленого.
- Последовательное разведение исследуемых соединений и контролей в 384-луночном планшете.
- Ферментативные реакции с использованием рекомбинантного человеческого SAMHD1 и пирофосфатазы с нуклеотидными субстратами или их аналогами.
- Колориметрическое определение неорганического фосфата с помощью реагента малахитового зеленого и измерение абсорбции при 630 nm.
- Нормализация данных, расчет Z-фактора для оценки качества анализа и построение кривых «доза-эффект» для определения эффективности ингибиторов.
Основные результаты
- Анализ надежно определяет активность SAMHD1 только при наличии всех компонентов.
- Известные ингибиторы SAMHD1 демонстрируют дозозависимое ингибирование; гидроксимочевина не ингибирует SAMHD1 in vitro.
- dGTP действует как аллостерический активатор, в то время как другим dNTP для активации требуется GTP.
- Клофарабинтрифосфат функционирует и как аллостерический активатор, и как субстрат; цитарабинтрифосфату для активности требуется аналог dGTP; гемцитабинтрифосфат не гидролизуется.
- Данный анализ позволяет идентифицировать низкомолекулярные ингибиторы и определять субстратную специфичность.
Выводы
- Метод анализа с использованием малахитового зеленого с ферментативным сопряжением является мощным высокопроизводительным инструментом для изучения активности и ингибирования SAMHD1.
- Он позволяет проводить скрининг низкомолекулярных ингибиторов и характеризовать взаимодействия с аналогами нуклеотидов.
- Данный метод способствует идентификации SAMHD1 в качестве терапевтической мишени для преодоления лекарственной устойчивости при раке.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Высокопроизводительные ферментативные сопряженные анализы активности SAMHD1 позволяют проводить быстрый количественный анализ взаимодействий малых молекул с ключевым регулятором нуклеотидного обмена. Эта возможность имеет решающее значение для валидации мишени, снижения механистических рисков и сортировки портфеля препаратов в рамках разработки онкологических и противовирусных лекарственных средств. Формат анализа с использованием малахитового зеленого обеспечивает масштабируемый скрининг и получение достоверных данных как для профилирования ингибиторов, так и для профилирования субстратов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Обеспечивает систематическое изучение SAMHD1 в качестве терапевтической мишени путем количественного анализа модуляции малыми молекулами.
- Способствует снижению механистических рисков за счет прямого измерения активности фермента в ответ на воздействие соединений-кандидатов.
- Облегчает функциональную валидацию аллостерических регуляторов и ингибиторов, имеющих значение для путей лекарственной устойчивости.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает стандартизированную высокопроизводительную платформу для скрининга библиотек соединений против SAMHD1.
- Позволяет получать воспроизводимые количественные данные, подходящие для определения зависимости «доза-эффект» и IC50.
- Обеспечивает масштабируемость анализа и возможность повторного использования платформы для различных классов соединений и их аналогов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стратегиям разработки трансляционных биомаркеров за счет характеристики взаимодействий между препаратом и ферментом, имеющих значение для резистентности к терапии.
- Обеспечивает непрерывность процесса от ранних этапов поиска до доклинической валидации потенциальных ингибиторов или субстратов.
- Помогает принимать обоснованные с учетом рисков решения о дальнейшем продвижении разработки путем уточнения субстратной специфичности и эффективности ингибиторов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный анализ применяется на стыке этапов валидации мишеней, поиска ведущих соединений и доклинических исследований механизмов действия для мишеней нуклеотидного обмена.
- Биологические исследования: Количественная оценка изменений активности фермента для проверки терапевтических гипотез и уточнения регуляторных механизмов.
- Скрининг: Обеспечение надежных и воспроизводимых результатов для отбора соединений и валидации хитов.
- Аналитика: Возможность построения кривых «доза-эффект», расчета Z-фактора и нормализации данных для сравнения различных условий.
- Трансляционные исследования: Связь модуляции фермента in vitro с потенциальными механизмами лекарственной устойчивости in vivo.
- Корпоративное повторное использование: Возможность адаптации метода для других фосфатаз с целью расширения области применения в портфеле исследований.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность взаимодействия с мишенью и эффективности ингибитора.
- Операционная ценность: Оптимизирует настройку анализа, стандартизацию и высокопроизводительный сбор данных.
- Стратегическая ценность: Повышает качество принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и снижает биологические риски на поздних стадиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию молекул-кандидатов и механистических мишеней с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области энзимологии, разработки анализов и количественного анализа данных.
- Необходим доступ к средствам получения рекомбинантных белков и высокопроизводительным планшетным ридерам.
- Требуется строгая стандартизация контролей и процедур нормализации между всеми исследовательскими группами.
- Метод адаптируется к различным аналогам нуклеотидов и библиотекам малых молекул с минимальными изменениями протокола.
- Диапазон детектирования и коррекция фона должны быть валидированы для каждого нового фермента или класса субстратов.
