Анализ объема лимфатических узлов с помощью ультравысокочастотной ультразвуковой визуализации в генно-инженерной мышиной модели меланомы Braf/Pten

Наш метод позволяет контролировать увеличение метастатического поражения паховых лимфатических узлов путем измерения увеличения их объема. Этот неинвазивный метод очень хорошо переносится, поэтому на одном и том же экспериментальном животном в течение двух недель могут быть запланированы несколько сеансов визуализации. Этот метод идеально подходит для оценки влияния фармакологического лечения на метастатическое заболевание.

Мы применили этот метод к модели меланомы Брафа/Птена, но в принципе он может быть адаптирован для оценки эффективности различных препаратов в различных доклинических мышиных моделях метастатического рака. Продемонстрировать процедуру будут д-р Марианна Витиелло, постдок из моей лаборатории, и д-р Клаудия Кусмич, научный сотрудник IFC-CNR. Для индукции меланомы наносите три микролитра пятимимолярного 4-гидрокситамоксифена примерно на один квадратный сантиметр бритой кожи верхней части спины в течение трех дней подряд.

Через шесть недель после окрашивания кожи используйте суппорты для измерения объема первичной опухоли и, в конечном итоге, подкожных метастазов. Затем используйте ультразвуковую визуализацию для измерения объема паховых лимфатических узлов. Проанализировав первичную опухоль и лимфатические узлы путем визуального осмотра, иссекают их для гистологических исследований.

После подтверждения анестезии переведите животное на подогреваемую доску станции ультравысокочастотной ультразвуковой томографии, удерживая животное в положении лежа на спине. Отрегулируйте температуру доски с помощью ректального зонда, смазанного вазелином, чтобы поддерживать температуру тела мыши в физиологическом диапазоне. Покройте передние и задние лапы проводящей пастой и приклейте их к электродам пластины ЭКГ, встроенным в доску.

Убедитесь, что физиологические параметры правильно получены и отображены. Удалите волосы с обеих паховых областей, нанеся средство для депиляции и покрывайте их акустической связующей средой. Затем зажмите ультравысокочастотный ультразвуковой линейный зонд в специализированный 3D-двигатель, встроенный в станцию визуализации, что позволит автоматизировать и ступенчато перемещать зонд.

Правильно сориентируйте и отрегулируйте положение ультразвукового зонда для получения изображений пахового лимфатического узла с коротким доступом и поместите интересующую область фокальной зоны. Установите расстояние сканирования от двух до пяти миллиметров, размер шага до 44 микрометров с результатом от 46 до 114 шагов сканирования на срез лимфатического узла и временем сбора от одной до трех минут на животное. Сканируйте весь объем пахового лимфатического узла в виде последовательности 2D изображений B-режима, получая изображения на нескольких уровнях путем линейного движения датчика с размерами шагов на микрометровом масштабе для генерации 3D-данных с точки зрения дыхания и сердечных циновых петель.

После получения изображения в цифровом виде сохраните полученные изображения в необработанном формате для дальнейшего автономного анализа. Для постобработки ультразвуковых изображений откройте набор данных 3D-изображений паховых лимфатических узлов, выберите многосрезовый метод и нажмите кнопку «Пуск», чтобы визуализировать как текущие кадры, так и миниатюры всех кадров, соответствующих каждому изображению, снятому во время 3D-съемки. Выберите миниатюру первого кадра, где лимфатический узел виден, чтобы загрузить его в контурное представление.

В контурном виде щелкните левой кнопкой мыши, чтобы сбросить точки вдоль границы лимфатического узла. После того, как нужное количество точек было установлено, щелкните правой кнопкой мыши, чтобы завершить контур. После завершения первого контура используйте представление эскизов, чтобы выбрать следующее изображение для контурирования.

При необходимости пропустите несколько изображений между контурами, чтобы уменьшить количество ручных трассировок, необходимых для каждого 3D-тома. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока не будет выделен весь том, затем нажмите «Готово». Находясь в рабочем пространстве окна 3D-режима, нажмите на значок измерения объема под областью отображения изображения, чтобы визуализировать числовое значение объема лимфатических узлов, и активируйте вид поверхности с помощью 3D-рендеринга объема лимфатических узлов.

Лечение мышей 4-гидрокситамоксифеном индуцирует активность фермента CreER, вызывая переключение на геномном уровне с Braf дикого типа на мутировавший Braf V600E, в то время как Pten теряется. Через четыре недели после лечения 4-гидрокситамоксифеном первичные опухоли достигают объема от 50 до 100 кубических миллиметров и их рост можно измерить суппортами в течение дополнительных двух недель, тем самым показывая постепенное увеличение пигментации, наблюдаемое в паховых лимфатических узлах. Отложения меланина неизменно обусловлены наличием метастазированных клеток меланомы, что подтверждается иммуногистохимическим окрашиванием антигена меланомы MelanA и Braf V600E.

В конце фазы сегментации все участки показывали наложение внешнего контура лимфатического узла. Здесь показаны 3D-визуализации правого пахового лимфатического узла, проанализированные через четыре, пять и шесть недель после лечения 4-НТ. Увеличение объема левого и правого паховых лимфатических узлов одного и того же животного с течением времени также было количественно определено.

Рекомендуется сочетать ультразвуковую визуализацию с соответствующим иммуногистохимическим окрашиванием, чтобы наличие раковых клеток было подтверждено на молекулярном уровне. Помимо лимфатических узлов, объем подкожных метастазов также можно контролировать с течением времени с помощью ультразвуковой визуализации. Если двухнедельный срок слишком короткий, чтобы оценить эффекты исследуемого препарата, выберите более периферический индукционный участок или менее склонный к опухоли генотип.