Использование постнатальной электропорации in vivo для изучения морфологии нейронов мозжечковых гранул и развития синапсов
9 июня 2021 г.
Здесь мы описываем метод визуализации синаптогенеза гранулярных нейронов в мозжечке мыши в течение периода постнатального развития мозга, когда эти клетки уточняют свои синаптические структуры и образуют синапсы, чтобы интегрироваться в общую цепь мозга.
Протокол изучает гранулярные нейроны мозжечка на разных стадиях развития, чтобы визуализировать ключевой морфологический рост. Преимущества метода включают в себя клеточное нацеливание, быструю экспрессию трансфицированных конструкций и разреженную маркировку клеток, что позволяет изучать клеточные автономные эффекты. Начните с вырезания 11,2-миллиметрового сегмента из наконечника загрузочной пипетки и поместите отрезанную часть на наконечник шприца Hamilton в качестве прокладки, чтобы ограничить глубину впрыска до 1,5 миллиметра.
Закрепите прокладку на наконечнике шприца с помощью клея или парапленки. Чтобы изучить морфологию одиночных электропорированных CGN из сагиттальных срезов мозга экспериментального щенка, сделайте снимки Z-стека с размером 0,5 микрометра на стек на конфокальный микроскоп. Изображение по одной ячейке на окно изображения, чтобы упростить анализ изображений и 3D-реконструкцию.
Проанализируйте длину нейрита и образование дендритного когтя вслепую, используя простой индикатор нейритов. Загрузите одноканальные Z-stack изображения электропорированных CGN на Фиджи и нажмите «Плагины»Сегментация«и Simple Neurite Tracer«Выберите «Создать новый 3D-просмотрщик»из выпадающего меню. Прокрутите до основания дендрита, соединяющегося с клеточной сомой и начните путь, нажав на соединение.
Вручную проведите трассировку пути, щелкнув участки, где сигнал заполнения ячейки наиболее яркий, и нажав клавишу Y, чтобы сохранить трассировку. Проведите до конца дендрита и подтвердите путь, нажав F.В качестве альтернативы проведите до основания когтя. Далее проведите коготь от основания конструкции до конца самого длинного нейрита.
Отследите вторичные и третичные ветви, удерживая нажатой клавишу Control в Windows или ALT в macOS и щелкнув путь. Подтвердите путь, нажав клавишу F.Обратите внимание, что измерения следов видны в отдельном окне. Сложите все размеры ветвей когтя, чтобы получить общую длину каждого когтя.
В репрезентативном анализе проекционные изображения электропорированных CGN от 3 до 14 дней после инъекции показали прогрессирующее снижение количества дендритов. CGN претерпели фазу дендритного роста с последующим уточнением с 3 DPI до 7 DPI, что привело к обрезке более 50% избыточных дендритов. Это событие совпадает с постепенным удлинением оставшихся беседок при образовании когтевидных структур в конце каждого дендрита, что указывает на то, что эти процессы развития происходят одновременно.
При 7 DPI когти были обнаружены примерно на 75% дендритов. Каждый меченый CGN был реконструирован в NMRS для количественной оценки общей площади и объема сомато-дендритной поверхности. Существенной разницы в размере CGN на протяжении всей разработки не наблюдалось.
Несмотря на то, что при 7 DPI CGN показали значительное снижение объема на 20% по сравнению с 3, 5 и 10 DPI. Самое главное в процедуре – точно локализовать мозжечок перед инъекцией. Метод может быть адаптирован для генетического манипулирования генами in vivo для изучения их роли в развитии гранулярных нейронов путем трансфекции либо шРНК, либо миРНК, либо Cre Recombinase.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол изучения морфологического развития гранулярных нейронов мозжечка (CGNs) в развивающемся мозжечке мыши с использованием электропорации in vivo. Данный метод позволяет осуществлять разреженное мечение и генетическую манипуляцию CGNs, что дает возможность детально анализировать рост дендритов, формирование «когтей» и синаптогенез на ключевых стадиях развития. Метод сочетает в себе точную инъекцию, конфокальную визуализацию и количественный морфометрический анализ для отслеживания созревания CGNs с течением времени.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология развития
- Клеточная биология
Теоретические основы
- В процессе развития мозга нейроны претерпевают значительные структурные и функциональные изменения.
- Мозжечок грызунов является модельной системой для изучения морфогенеза отдельных клеток, в частности, зернистых клеток мозжечка (CGNs).
- CGNs формируют специализированные дендритные «когти», которые имеют решающее значение для синаптического входа.
- Традиционные методы маркировки часто характеризуются недостаточной клеточной специфичностью или низким временным разрешением.
Цель исследования
- Визуализировать и количественно оценить морфологическое развитие отдельных CGN in vivo.
- Отслеживать рост дендритов, прунинг и формирование «когтей» на разных этапах развития.
- Обеспечить платформу для клетко-автономных генетических манипуляций с CGN.
Используемые методы
- Электропорация in vivo предшественников гранулярных нейронов в развивающемся мозжечке мыши.
- Разреженное мечение CGN для четкого морфологического анализа.
- Конфокальная микроскопия с построением Z-стека для 3D-реконструкции.
- Ручное прослеживание и количественная оценка длины нейритов и структур дендритных когтей с использованием Fiji и Simple Neurite Tracer.
Основные результаты
- Проекционные изображения с 3-го по 14-й день после инъекции (DPI) выявили прогрессивное снижение количества дендритов на одну CGN.
- В период между 3-м и 7-м DPI в CGN происходил дендритный прунинг, в результате которого было удалено более 50% избыточных дендритов.
- На концах сохранившихся дендритов образовались когтеобразные структуры; к 7-му DPI такие «когти» присутствовали примерно на 75% дендритов.
- Размер CGN оставался в основном неизменным, хотя на 7-й DPI наблюдалось значительное снижение объема на 20% по сравнению с другими временными точками.
Выводы
- Данный протокол позволяет проводить детальный клеточно-специфический анализ морфологического развития CGN in vivo.
- Прунинг дендритов и формирование «когтей» являются параллельными процессами в ходе созревания CGN.
- Метод может быть адаптирован для генетических манипуляций с целью изучения функции генов при развитии CGN.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественный анализ in vivo морфологии зернистых нейронов мозжечка (CGN) и развития синапсов отвечает критической потребности в прогностической уверенности при валидации мишеней нейропсихического развития. Возможности разреженного мечения и генетических манипуляций позволяют снизить механистические риски на самых ранних этапах поиска средств воздействия на ЦНС. Данный подход обеспечивает трансляционную преемственность, связывая клеточный морфогенез с синаптической интеграцией, что позволяет обосновывать стратегические решения в области НИОКР по нейробиологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Позволяет напрямую изучать функцию генов в морфогенезе и синаптогенезе зернистых клеток мозжечка (CGN).
- Обеспечивает механическое снижение рисков за счет изоляции клеточно-автономных эффектов in vivo.
- Предоставляет количественные показатели для валидации мишеней на основе выдвинутых гипотез.
- Способствует отбору нейроонтогенетических мишеней на основе морфологических и синаптических фенотипов.
Скрининг и разработка анализа
- Устанавливает валидированные, воспроизводимые рабочие процессы визуализации и анализа морфологии нейронов.
- Предоставляет количественные показатели, такие как количество дендритов, формирование «когтей» (claw formation) и длина нейритов, для последующего скрининга.
- Обеспечивает стандартизацию анализа за счет «слепого» морфометрического анализа с помощью программного обеспечения.
- Подготавливает устойчивые биологические системы для скрининга соединений или генетического скрининга в рамках исследований ЦНС.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет морфологические фенотипы с развитием синапсов, имеющим значение для заболевания, на моделях грызунов.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации методов нейроонтогенетического вмешательства.
- Предоставляет платформу для оценки трансляционных биомаркеров созревания синапсов.
- Снижает риски при дальнейшем продвижении исследования, связывая клеточные изменения с функциональными результатами в синапсах.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод объединяет этапы от раннего поиска до идентификации ведущих соединений в исследованиях ЦНС, позволяя проводить итерационную проверку гипотез и количественное фенотипирование генетических или фармакологических воздействий.
- Биология открытий: Обеспечивает проверку нулевой гипотезы о функции генов в нейрональном морфогенезе и формировании синапсов.
- Скрининг: Предоставляет воспроизводимые количественные данные для анализа структуры дендритов и синапсов.
- Аналитика: Обеспечивает проведение «слепого» программного измерения длины нейритов, количества дендритных отростков и объема клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает клеточные фенотипы с развитием синапсов при заболеваниях in vivo.
- Корпоративное повторное использование: Применимо для различных генетических манипуляций и модельных систем ЦНС в рамках программ научных открытий.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования при валидации мишеней нейроразвития и снижении механистических рисков.
- Операционная ценность: стандартизирует визуализацию in vivo и морфометрический анализ для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований, связывая генные пертурбации с количественно определяемыми нейрональными фенотипами.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию мишеней ЦНС с учетом рисков на основе надежных данных in vivo.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области нейроанатомии грызунов и владение методами точного стереотаксического введения препаратов.
- Необходим доступ к конфокальной микроскопии и специализированному программному обеспечению для анализа изображений (например, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- Необходима стандартизация процедур между участниками исследования для проведения слепого анализа и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован под различные генетические конструкции (shRNA, siRNA, Cre-рекомбиназа) для проведения клеточно-автономных исследований.
- Точность инъекции и эффективность маркировки клеток являются критическими факторами для получения воспроизводимых результатов.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
