Идентификация белков антибактериального иммунитета в кишечной палочке с использованием MALDI-TOF-TOF-MS/MS и нисходящего протеомного анализа

Протокол демонстрирует быстрый метод идентификации бактериальных белков с помощью индукции антибиотиков и масс-спектрометрии. Главным преимуществом техники является ее скорость и простота. Пробоподготовка несложная.

Метод может быть распространен на характеристику любых патогенных бактерий, таких как факторы вирулентности или устойчивость к антибиотикам, чтобы лучше информировать о соответствующем лечении бактериальной инфекции. Для начала используйте стерильную петлю в один микролитр для сбора бактерий из отдельных колоний, выращенных на агаровой пластине LB. И переложить на двухмиллилитровую уплотнительная кольцевая кольцевая линия винтовой крышки микроцентрифуги трубки, содержащей 300 микролитров воды класса ВЭЖХ.

Затем кратковременно вихрьте трубку и гранулируют ячейки центрифугированием, на 0,75 микролитра реликтовой воды образца супернатанта на мишени MALDI из нержавеющей стали и дайте ей высохнуть. Налейте высушенное место образца 0,75 микролитра насыщенного раствора синапиновой кислоты, приготовленного в 33% ацетонитриле, 67% воды и 0,2% трифторуксусной кислоты, и дайте пятну высохнуть. Как только пятно высохнет, загрузите мишень в масс-спектрометр.

Откройте программное обеспечение для сбора данных и щелкните MS Linear Mode Acquisition Или диапазон массы-заряда и массы-заряд нижней и верхней границ в соответствующих полях. Нажмите на место образца для анализа в целевом шаблоне MALDI. Затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции или ионизации.

Отпустите кнопку мыши, чтобы начать сбор и собрать 1000 лазерных снимков для каждого образца пятна. Если ионы не обнаружены, увеличьте интенсивность лазера, регулируя скользящую шкалу стержень под интенсивность лазера до тех пор, пока не будет обнаружен сигнал ионов белка. После завершения сбора данных в линейном режиме MS щелкните сбор режима ms/MS Reflectron.

Введите массу прекурсора для анализа в поле Масса прекурсора. Затем введите ширину изоляции в дальтонах в окне «Масса предшественника» для стороны низкой и высокой массы массы предшественника. Нажмите кнопку CID Off (Выключить CID).

Затем нажмите кнопку Metastable Suppressor On (Вк) Отрегулируйте интенсивность лазера по крайней мере до 90% от его максимального значения, отрегулировав скользящую шкалу, как показано на демонстрации. Щелкните место для анализа образца на целевом шаблоне MALDI, затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции или ионизации, отпустите кнопку мыши, чтобы начать сбор и собрать 10 000 лазерных снимков для каждого места образца, как показано.

Дважды щелкните исполняемый файл Protein Biomarker Seeker, и появится окно графического интерфейса пользователя. Введите массу биомаркера белка в поле «Масса зрелого белка» и погрешность измерения массы в поле «Массовая толерантность». При желании нажмите кнопку «Калькулятор массы белка в зависимости от b/y», чтобы рассчитать массу белка из предполагаемой дополнительной пары ионов фрагментов, и появится всплывающее окно инструмента «Калькулятор массы белка».

Введите отношение массы к заряду предполагаемой пары дополнительных фрагментов ионов, нажмите кнопку «Добавить пару», и появится калькулятор белковой массы. Скопируйте вставьте это значение в поле «Масса зрелого белка» и закройте окно инструментов «Калькулятор массы белка». Нажмите на поле Установить ограничение остатков.

Выберите длину пептида конечного сигнала терминала, и появится всплывающее окно со скользящей шкалой и курсором и переместит курсор на нужную длину сигнального пептида. Если длина сигнального пептида не выбрана, программное обеспечение будет выполнять неограниченное усечение последовательности. В разделе Условие фрагмента ионов выберите Остатки для полипептидного магистрального расщепления, щелкнув по полям одного или нескольких остатков, D-E-N и / или P.А затем нажмите кнопку Ввести fragment Ions Plus One для поиска, и появится всплывающая страница фрагмента.

Затем нажмите кнопку «Добавить ион фрагмента», и появится выпадающее поле для каждого вводимого фрагмента. Введите массу по соотношениям зарядов ионов фрагментов и связанную с ними массу по допуску заряда. Затем нажмите кнопку Сохранить и закрыть.

В правом боковом поле Сколько фрагментов ионов должно быть сопоставлено прокрутите, чтобы выбрать минимальное количество фрагментов ионов, которые должны быть сопоставлены для идентификации, и выберите остатки цистеина в их окисленном состоянии. Если белки не идентифицированы после поиска, повторите поиск с цистеинами в их восстановленном состоянии. В разделе Настройка файла щелкните значок Выбрать файл FASTA, чтобы просмотреть и выбрать файл FASTA, содержащий последовательности белка in silico ранее созданного бактериального штамма.

Затем выберите выходную папку и создайте имя выходного файла. Щелкните значок Выполнить поиск по записям файлов. Появится всплывающее окно под названием «Подтвердить параметры поиска», отображающее параметры поиска перед началом поиска.

Если параметры поиска верны, нажмите кнопку Начать поиск. Если параметры неправильные, нажмите кнопку Отмена и повторно введите правильные параметры. Как только поиск будет инициирован, окно параметров закроется и появится новое всплывающее окно с индикатором выполнения, показывающее ход поиска и бегущий подсчет количества найденных идентификаций.

По завершении поиска индикатор выполнения будет автоматически закрыт, а сводка поиска будет отображаться в поле журнала графического интерфейса пользователя вместе с новым всплывающим окном, отображающим найденные идентификаторы белков. В текущем исследовании бактериальные культуры выращивались в LB с двумя различными концентрациями митомицина-C. Массовый спектр бактериальной культуры, выращенной с концентрацией митомицина-С.

Были идентифицированы белок холодного шока С, белок холодного шока Е и плазмидный белок неизвестной функции. Неизвестный ион белка на 9780 был проанализирован MS/MS, и ион-предшественник был выделен с окном селектора временных ионов примерно 100 дальтон. Фрагмент иона при массе заряда 9675,9 является побочным эффектом диссоциации метастабильной белковой иона при 9655.

Последовательность белка иммунитета для колицина Е3 содержит основной остаток возможных участков ионизации. Фрагмент ионов обнаружен из полипептидного магистрали расщепления, когда при поиске использовалась восстановленная форма цистеина. N-концевой метионин удаляется как модификация постперевода.

Когда бактериальную культуру выращивали в высокой концентрации митомицина-С, был идентифицирован белок иммунитета бактериоцина. Неизвестный пик в 9651 был проанализирован MS/MS, и ион-предшественник был выделен с более узким и асимметричным окном TIS минус 75 плюс 60 дальтон. Последовательность иммунитета белка бактериоцина содержит основные остатки возможных участков ионизации.

Фрагмент ионов обнаружен из полипептидного магистрали расщепления, когда при поиске использовалась восстановленная форма цистеина. при различных концентрациях антибиотиков относительное содержание белка может варьироваться. И они были проанализированы с помощью масс-спектрометрии.

При сборе бактериальных клеток наблюдают морфологию колоний и рост бактерий относительно антибиотиков и концентрации. Для обнаружения белков необходима одна микролитровая петля клеток.