Активация и конъюгация растворимых полисахаридов с использованием 1-циано-4-диметиламинопиридина тетрафторбората (CDAP)

Полисахариды плохо иммуногенны, если они не связаны с белком и должны быть активированы для дериватизации или конъюгации с белками. В этом методе CDAP используется в качестве песчаного коносаментного реагента. CDAP активирует гидроксилы полисахарида для дериватизации или для связывания с белками для использования в вакцинах или диагностических реагентах.

CDAP в значительной степени заменил цианобромид в качестве полисахаридного песчаного реагента. CDAP проще в использовании, более эффективен и может использоваться при более низком рН, чем бромид циана. Это гораздо лучший активирующий реагент.

CDAP можно использовать с большинством полисахаридов, в отличие, скажем, от восстановительного аминирования, которое требует вицинальных гидроксилов. Химия может быть использована как для прямого, так и косвенного конъюгировать с белками, и она может быть использована для изготовления диагностических реагентов. Реакция активации CDAP, как первоначально описано, была очень быстрой и трудной для контроля.

Протокол, представленный здесь, делает химию намного проще в выполнении и гораздо более воспроизводимой. Перед началом эксперимента отрегулируйте рН раствора полисахарида до 9, добавив 200 микролитров раствора диметиламинопиридина по каплям при перемешивании. Держите реакцию охлажденной на ледяной водяной бане в течение всего процесса активации.

Продолжают с активацией циано-диметиламинопиридина-тетрафторбората или CDAP путем переноса 100 микролитров CDAP в раствор полисахарида при перемешивании. Запустите таймер и следите за изменением pH в течение всей активации в течение 15 минут. Поддерживают реакцию при целевом рН путем быстрого добавления 10 микролитровых приращений 0,1 молярного гидроксида натрия.

Когда оптимальное время активации достигнуто, добавьте два миллилитра 0,5 молярного адигидразида одновременно к активированному полисахариду. Убедитесь, что рН находится в требуемом диапазоне для функционализации гидроксида. После непрерывного перемешивания реакционной смеси в течение, по меньшей мере, одного часа, перенесите реакционную смесь до четырех градусов Цельсия.

Чтобы снизить концентрацию АДГ в продукте, диализуйте сырой производный раствор полисахарида с помощью диализного устройства. Извлеките производный полисахарид из диализа и определите концентрацию полисахаридов и гидразида для расчета соотношения гидразида к полисахариду. Готовят один миллиграмм на миллилитр немодифицированного раствора полисахарида для использования в качестве стандарта.

Разогрейте нагревательный блок до 140 градусов Цельсия в течение как минимум одного часа для достижения стабильной равномерной температуры. Используйте защитную прокладку под и вокруг нагревательного блока в случае разливов кислоты. Добавьте различные объемы в один миллиграмм на миллилитр стандартного углевода к маркированным пробиркам 13 на 100 боросиликатов в трехличных и составьте объем до 100 микролитров с водой для достижения желаемых стандартных концентраций.

Аналогичным образом, настройте пробные анализы, добавив объем, содержащий пять микрограммов дериватизированного полисахарида, в три пробирки для образцов. Добавьте 100 микролитров свежеприготовленных шести миллиграммов на миллилитр резорцина в каждый тюбик. Используя повторную трубку, добавьте 300 микролитров приготовленной 75% серной кислоты в каждую трубку, энергично вихрьте трубки, направив трубку в сторону, затем поместите все трубки в блок нагревателя в устойчивом темпе в последовательном порядке и немедленно установите таймер на три минуты.

Через три минуты снимите трубки в том же порядке и поместите их непосредственно в стойку на водяной бане. Снимите ледяные трубки, чтобы они уравновешивали до комнатной температуры в течение пяти минут. Считывание поглощения всех трубок на спектрофотометре UV-Vis на 430 нанометров с использованием кюветы длиной 10 миллиметров.

Чтобы настроить реакции анализа, отсортируйте и расположите помеченные стандартные трубки в трубной стойке в порядке увеличения концентрации. Используя калиброванную микропипетку, добавьте 100 микролитров эталонов в каждую соответствующую трубку. Для нулевого стандарта используйте 100 микролитров буфера образца.

Аналогичным образом, подготовьте и расположите пробирки для образцов. Затем, используя калиброванную микропипетку 1000 микролитров, добавьте 875 микролитров буфера анализа во все пробирки. Чтобы начать реакцию анализа, в течение пяти минут добавляют 25 микролитров 1% тринитробензоловой сульфоновой кислоты в каждую пробирную трубку в заданном порядке.

Вращайтесь в пробирных трубках в течение двух секунд на высокой скорости, следя за тем, чтобы жидкость закручивалась на высоту полдюйма от отверстия трубки. Запишите время начала анализа и установите таймер на два часа. Затем поместите стойку для пробирки в темное время суток при комнатной температуре на два часа.

Когда время закончится, вихрь трубок и приступайте к сбору данных. Декстран АДГ был проана на декстран с использованием анализа серной кислоты резорцинола. Была построена типичная стандартная трубка, использующая глюкозу в качестве стандарта сахара.

Содержание гидразида в дериватизированном полисахариде или декстране определяли с помощью анализа TNBS. Уровень дериватизации рассчитывали как гидриды на 100 килодалтон декстрана для облегчения сравнения полимеров с различной средней молекулярной массой. Протокол, описанный здесь, возможно, потребуется адаптировать для конкретного полисахарида.

Химия CDAP может быть использована для функционализации полисахаридов для использования с широким спектром конъюгационных реагентов. Его можно использовать, например, для биотинилата полисахаридов для использования в ИФА. Белки могут быть напрямую связаны с CDAP-активированными полисахаридами, но это обычно требует некоторой оптимизации для конкретного полисахарида.

Выход конъюгации может составлять более 75% Использование химии CDAP позволило создать недорогие конъюгированные вакцины, подобные тем, которые производятся, например, Институтом сыворотки Индии.