Тест активации базофилов для диагностики аллергии

Тест активации базофилов представляет собой дополнительный диагностический тест in vitro для оценки аллергических реакций, опосредованных IgE, которые оказались полезными для реакций, вызванных лекарствами, пищей или ингалянтами, а также при некоторых формах хронической крапивницы. Этот тест основан на определении базофильного ответа на аллерген или поперечно связывающую активацию IgE лекарственного средства путем измерения маркеров активации с помощью проточной цитометрии. Тест активации базофилов может быть полезным и дополнительным инструментом, позволяющим избежать контролируемых тестов для подтверждения диагноза аллергии, особенно у субъектов, испытывающих серьезные опасные для жизни реакции.

Кроме того, этот тест имеет преимущество в том, что он может анализировать реакцию против любого препарата или аллергена по сравнению с другими методами in vitro, которые доступны только для нескольких лекарств и аллергенов. Основные ограничения теста связаны с неоптимальной чувствительностью, особенно при лекарственной аллергии. Необходимость выполнения теста не дольше 24 часов после извлечения образца и отсутствие стандартизации между лабораториями и диагностическими алгоритмами.

Начните со сбора периферической крови в девяти миллилитровых гепаринизированных пробирках и поместите образцы в ротор, чтобы поддерживать их при комнатной температуре до тех пор, пока они не потребуются для экспериментального протокола. Пометьте две пять миллилитровых цитометрических пробирок каждая для отрицательного контроля и положительного контроля. Также пометьте по одной пробирке для различных испытуемых концентраций аллергена или лекарственного средства.

Затем поместите трубки в стойку так, чтобы трубки идеально подходили, не скользя. Для первого положительного контроля готовят четырехмикролярный раствор N-формилметионил-лейцил-фенилаланина или fMLP в 0,05% PBS-T для подтверждения качества базофилов. Для второго положительного контроля приготовьте 0,05 миллиграмма на миллилитр анти-IgE раствора с использованием PBS-T.

Приготовьте окрашивающую смесь, добавив по одному микролитру на 20 микролитров стимулирующего буфера. Затем добавьте 23 микролитра этой окрашивающей смеси в каждую трубку. Добавьте 100 микролитров PBS-T к отрицательным контрольным трубкам.

Добавьте 100 микролитров fMLP к одной из положительных контрольных трубок и добавьте 100 микролитров анти-IgE E к другой к остальным трубкам. Добавьте 100 микролитров различных концентраций аллергена или препарата и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. После инкубации аккуратно добавьте 100 микролитров крови в каждую пробирку, чтобы избежать гемолиза.

Затем осторожно вихрьте трубки и высиживайте их в течение 25 минут при 37 градусах Цельсия в термостатической ванне со средним перемешиванием. Держите трубки при четырех градусах Цельсия не менее пяти минут, чтобы остановить дегрануляцию. К каждой трубке добавляют два миллилитра лизирующего буфера для лизирования эритроцитов.

Вращайте каждую трубку, а затем инкубируйте трубки в течение пяти минут при комнатной температуре. Центрифугируйте пробирки по 300 г при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Затем переверните стойку в раковину, чтобы декантировать супернатант, в то время как ячейки остаются на дне трубок.

Добавьте три миллилитра PBS-T в каждую трубку, чтобы промыть клетки и вихрь трубок. Выполните второй раунд центрифугирования, используя тот же набор параметров, и декантируйте супернатант, опрокидывая стойку в раковину. Затем держите образцы при четырех градусах Цельсия защищенными от света до проточной цитометрии.

Подключите проточный цитометр к программному обеспечению компьютера и подождите, пока цитометр не будет готов. Загрузите шаблон и настройки инструмента, как описано в текстовой рукописи. Начните процесс получения образца.

Чтобы отобрать активированные базофилы, сначала закройте лимфоциты с графика бокового рассеяния-прямого рассеяния. Затем загораживают базофилов из популяции лимфоцитов в виде клеток CCR3 + CD203c + и приобретают не менее 500 базофилов на трубку. Установите порог CD63 примерно на 2,5% с помощью отрицательных контрольных пробирок и проанализируйте образцы.

IgE-зависимые реакции гиперчувствительности исследовали путем проведения теста на активацию базофилов, или BAT, с использованием аллергенов и лекарств. Чувствительность базофилов анализировали путем измерения реактивности при многократно снижающихся концентрациях аллергена, которые помогают определить аллергическую концентрацию, которая индуцирует реакцию 50% базофилов или EC50. Во-первых, лимфоциты были закрыты от бокового диаграммы рассеяния вперед.

Затем базофилы были закрыты из популяции лимфоцитов в виде CCR3 + CD203c + клеток. Затем график CCR3-CD63 был использован для анализа активации базофилов с использованием CD63 в качестве маркера активации для двух препаратов и разных концентраций аллергена. Тест проводится со свежей цельной кровью и должен выполняться не дольше, чем через 24 часа после извлечения крови.

Стимул, используемый в тесте, не должен включать какие-либо вспомогательные вещества, и необходимо учитывать химические характеристики лекарств. Другие дополнительные методы in vitro для диагностики IgE-опосредованных аллергических реакций, или определение sIgE, или тест на высвобождение гистамина.