Визуализация и количественная оценка сигнализации TGFβ/BMP/SMAD в различных условиях напряжения сдвига жидкости с использованием бесконтактного лигирования

Этот протокол позволяет ученым количественно сравнивать количество комплексов транскрипционных факторов в различных условиях напряжения сдвига и будет полезен для исследований в области сосудистой биологии. Основным преимуществом этого протокола является использование микрофлюидных каналов потока, которые позволяют исследовать несколько пар антител, включая соответствующие элементы управления одновременно. Для начала покройте шестиканальный слайд, добавив 0,1% желатина из свиной кожи, приготовленного в PBS, в каналы в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.

Очистите каналы от желатинового раствора и семени Huvecs в предварительно закодированных шестиканальных слайдах с плотностью от 2,5 раз 10 до шестых клеток на миллилитр в 30 микролитрах полной среды M199. Дайте клеткам прилипнуть в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе. Добавьте 60 микролитров предварительно предупрежденной полной среды M199 к каждому из резервуаров.

Культивируйте клетки при 37 градусах Цельсия в течение двух дней в увлажненном инкубаторе со средним замещением через 24 часа. Установите кремниевую трубку на жидкостные блоки, заполните резервуары минимум 10 миллилитрами предварительно предупрежденной полной среды M199. Подключите жидкостные блоки с трубками к насосной системе и выполните предварительный запуск без ячеек для уравновешивания среды и удаления оставшегося воздуха.

Подключите одиночные каналы на шестерых каналах с помощью трубки последовательного соединения. Подключите первый и последний канал на затворе к трубкам, установленным на блоке жидкости. Для воздействия на клетки высоких уровней явного стресса увеличьте шаг явного стресса с фазами адаптации, установив шаги с шагом пять динов на квадратный сантиметр в 30 минут.

Используйте сгустки на трубке, чтобы отсоединить горки от насосов после воздействия напряжения сдвига жидкости, избегая разлива среды в инкубаторе, и передавайте слайды потока на льду. При отсоединении трубки от резервуаров используйте палец, чтобы закрыть другую сторону резервуара, чтобы избежать захвата пузырьков воздуха в канале. Удерживая скольжение потока по льду, осторожно аспирируйте среду из резервуаров, но не из канала, где находятся клетки.

Промыть образцы 90 микролитрами холодного стерильного PBS, добавив PBS в один резервуар и осторожно аспирировать из другого резервуара, затем повторить для всех каналов. Зафиксируйте ячейки, добавив 90 микролитров буферизованного 4%-ного раствора PFA в тот же резервуар, куда был добавлен PBS, и аспирируйте жидкость из другого резервуара, как показано на рисунке. После фиксации клеток во всех шести каналах перенесите образцы со льда на комнатную температуру и инкубируйте в течение 20 минут.

Промыть ячейки три раза PBS, добавив PBS в один резервуар и осторожно аспирируя его из другого резервуара во всех каналах, заботясь о том, чтобы не высушить каналы. Закалка доступа PFA путем добавления 90 микролитров окружающего 15 миллимолярного хлорида аммония, приготовленного в PBS, в один из резервуаров. Аспирировать из другого резервуара и инкубировать клетки в течение 10 минут.

Пермеабилизируют клетки, добавляя 90 микролитров 0,3%Triton X 100, приготовленных в PBS в пустой резервуар. Аспирировать из другого резервуара для каждого канала и инкубировать в течение 10 минут, затем трижды промывать PBS, как показано ранее. На 90 микролитров стерильного PLA блокирующего раствора в один резервуар.

Аспирировать с другой стороны для каждого канала и инкубировать в течение одного часа при 37 градусах Цельсия в увлажненной камере. Добавьте первичные антитела в разбавитель антител PLA и вихрь. Осторожно аспирируйте блокирующий раствор из резервуаров и каналов.

Добавьте 30 микролитров раствора первичного антитела сразу в пустой канал, наклонив затвор при добавлении раствора. Повторить для всех каналов и инкубировать при четырех градусах Цельсия в увлажненной камере на ночь или при 37 градусах Цельсия в течение одного часа. Разбавляйте минус кролик и плюс мышь PLA зонды от одного до пяти в разбавителе антител PLA.

Промыть все каналы два раза, добавив 90 микролитров промывочного буфера А и аспирации, как показано на рисунке. После аспирации промывочного буфера добавьте 30 микролитров зондового раствора PLA и инкубируйте в увлажненной камере. Разбавьте буфер лигирования от одного до пяти в D-ионизированной воде и разбавьте фермент лигуса от одного до 40 в разбавленном лигационном буфере.

После промывки и полного аспирирования промывочного буфера А добавьте 30 микролитров лигирующего раствора в пустые каналы при наклоне затвора и высиживайте в увлажненной камере. Разбавьте буфер амплификации от одного до пяти в деионизированной воде, затем разбавьте фермент полимеразы от одного до 80 в разбавленном буфере амплификации на льду. После промывки и полного аспирации промывочного буфера А добавьте 30 микролитров раствора усиления в пустые каналы при наклоне затвора и высиживайте его в увлажненной камере.

Разбавьте DAPI от одного до 500 в буфере промывки B и промыть все каналы один раз, добавив 90 микролитров DAPI, содержащего промывочный буфер B, и аспирацию, как показано, для пропаривания ядер. Затем промывайте все каналы один раз с помощью промывочного буфера B без DAPI. Разбавьте промывочный буфер B от одного до 10 в деионизированной воде и промыть все каналы один раз 90 микролитрами разбавленного промывочного буфера B. После аспирации промывочного буфера B немедленно добавьте две-три капли жидкой монтажной среды в один резервуар и наклоните затвор, чтобы распределить монтажную среду по всем каналам.

Храните образцы при четырех градусах Цельсия во увлажненной среде до получения изображения. Хувеки подвергались высокому и низкому стрессу. Низкий стресс сдвига увеличивал белковые взаимодействия SMAD в цитозоле и ядрах.

Контроль с одним антителом показал отсутствие или очень мало сигналов, доказывая успех эксперимента. Повышенная концентрация антител привела к большему количеству событий PLA на клетку, но разница в сигналах PLA между клетками с высоким и низким уровнем стресса была уменьшена. Самодельные буферы для блокировки и разбавления антител могут быть использованы в качестве альтернативы коммерческим буферам.

Количественная оценка событий PLA для коммерческих и самодельных разбавляющих и блокирующих решений показала одинаковую картину сигналов PLA в цитозольной и ядерной областях. Тем не менее, общее количество событий PLA на ячейку было выше с коммерческими решениями. Комбинация антител SMAD Two/Three, SMAD Four использовалась там, где антитело SMAD Four не подходило для экспериментов по иммунофлуоресценции.

Не было никакой разницы в событиях PLA в экспериментальном и контрольном состоянии, что указывает на важность выбора правильной комбинации антител для обнаружения событий PLA. Описанный протокол может быть адаптирован для обнаружения взаимодействий комплексов транскрипционных факторов, отличных от SMAD, и, следовательно, помочь понять регуляцию генов в атеро-предохранительных условиях.