Использование базового покрытия и минископа Preanchored с объективом для исследования переходных процессов кальция на мышах

Этот минископ может уменьшить проблему усадки с зубным цементом во время процедуры опорной плиты и увеличить вероятность успешности записи минископом флуоресцентных сигналов в конфигурации с двумя длинами. Если флуоресцентный переходный процесс не может наблюдаться во время покрытия основания, проверьте экспрессию индикатора кальция и расположение релейной линзы на срезе мозга. Начните с установки внутренней иглы внутривенного катетера 20 калибра диаметром один миллиметр на стереотаксическую руку.

Опустите катетер в вентральную кукурузу ammonis 1 в целевую область. Затем опустите микроинъекционную иглу со скоростью от 100 до 200 микрометров в минуту в вентральный cornu ammonis 1 и вливайте 200 нанолитров вирусного вектора в целевую область со скоростью 25 нанолитров в минуту. После того, как вирусу рассеялся в течение 10 минут, извлеките микроинъекционную иглу со скоростью от 100 до 200 микрометров в минуту.

После дезинфекции релейной линзы замочите хрусталик в холодном безпирогеновом физиологическом растворе до имплантации. Используя зажим микро бульдога с термоусадочной трубкой, удерживайте релейную линзу и поместите ее поверх целевой области со скоростью от 100 до 200 микрометров в минуту. Затем стабилизируйте хрусталик зубным цементом.

Чтобы установить минископ, закрепите объектив на дне и соберите опорную пластину на минископ. Оберните 10 сантиметров парафиновой пленки вокруг внешней стороны опорной плиты. Используя многоразовую клейкую глину, удерживайте минископ со стереотаксическим датчиком руки.

Выровняйте объектив поверх релейной линзы с как можно меньшим пространством между объективами. Используйте зубной цемент, чтобы закрепить позиционирование опорной плиты, так что цемент касается только парафиновой пленки. Когда зубной цемент высохнет, удалите парафиновую пленку, опорную пластину и минископ, оставив зубную цементную основу пустой.

Запечатайте линзу реле формовочным силиконовым каучуком и покройте силиконовую резину тонким слоем зубного цемента. Отсоедините мышь от стереотаксических инструментов и поместите мышь в камеру восстановления. Для нанесения фундамента аккуратно вырежьте тонкий слой зубной цементной крыши с помощью костного роггера и удалите силиконовую резину.

Очистите поверхность релейной линзы спиртом 75%. Прикрепите установленный винт рядом с опорной плитой, чтобы закрепить его на нижней части минископа. Отрегулируйте скольжение фокусировки примерно на расстоянии от 2,7 до 3 миллиметров от основного корпуса.

После завершения настройки подключите минископ к плате сбора данных и подключите минископ к порту USB 3.0 на компьютере. Запустите программное обеспечение для сбора данных, разработанное командой UCLA. Отрегулируйте экспозицию до 255, коэффициент усиления до 64x и светодиод возбуждения до 5%Чтобы подключить минископ к программному обеспечению для сбора данных, нажмите кнопку подключения и посмотрите прямую трансляцию программного обеспечения для сбора данных, рассматривая край релейного объектива в качестве ориентира.

Как только релейная линза будет найдена, выровняйте объектив минископа с релейной линзой вручную. Регулируя различные углы и расстояния минископа, начинаем поиск флуоресцентных сигналов. Удерживая минископ в оптимальном положении, переместите стереотаксическую руку в сторону мини-прицела и приклейте минископ к стереотаксическому рычагу многоразовой клейкой глиной.

Найдите лучший обзор, немного отрегулировав кронштейны X, Y и Z. Отрегулируйте угол между поверхностью объектива и релейной линзой, повернув ушную перекладину, зубчатую планку или многоразовую клейкую глину по оси Z. Вирусная экспрессия и имплантация хрусталика успешны, когда по крайней мере одна клетка смещает флуоресцентные переходные процессы во время базового покрытия.

Закрепите опорную плиту как можно меньшим количеством зубного цемента, контролируя интересующую область, чтобы убедиться, что оптимальное положение не изменится. В репрезентативном исследовании процедура фиктивного покрытия оказалась предпочтительной, поскольку она привела к меньшему смещению местоположения опорной плиты, чем первоначальная процедура. На смещение опорной плиты также повлияла высота зубного цемента.

Опорная плита, которая была закреплена на 0,5 сантиметра над черепом, смещалась значительно меньше, чем опорная пластина, которая была закреплена на один сантиметр над черепом. В примере успешной визуализации во время процедуры обшивки основания у анестезируемого животного были замечены флуоресцентные переходные процессы вместе с кровеносными сосудами. Флуоресцентные переходные процессы наблюдались через пять дней после нанесения покрытия даже тогда, когда мышь свободно вела себя в своей домашней клетке с небольшим сдвигом в положении.

Впоследствии была проведена кальциевая визуализация мышей. В некоторых случаях во время процедуры нанесения опорных покрытий возникали проблемы, такие как отсутствие чего-либо, кроме однородного фона или видимости полей белых клеток. без флуоресцентных переходных процессов.

Важно прочно закрепить опорную плиту на целевой области с наименьшим возможным количеством зубного цемента. С помощью сланцевой техники исследователи могут продольно наблюдать нейронную активность через это. При наличии соответствующей лицензии эта процедура также может применяться для наблюдения за нейронной сетью в поле зрения.