Трехмерная биомиметическая модель нейробластомы in vitro с использованием скаффолдов на основе коллагена

В этой статье перечислены шаги, необходимые для посева клеточных линий нейробластомы на ранее описанные трехмерные каркасы на основе коллагена, поддержания роста клеток в течение заранее определенного периода времени и извлечения каркасов для нескольких анализов роста и поведения клеток, а также последующих приложений, адаптируемых для удовлетворения ряда экспериментальных целей.

Наш протокол предлагает 3D-биоинженерную модель, которая тесно воздействует на нативную ткань. Это потенциально может быть использовано для открытия новых терапевтических средств и биомаркеров для лечения и диагностики нейробластомы. Основное преимущество заключается в том, что он создает более физиологически значимые экспериментальные условия для изучения микроокружения опухоли с использованием воспроизводимой методики, которая обеспечивает постоянство от партии к партии.

Наш метод скаффолда может быть использован, во-первых, для выявления новых терапевтических средств для нейробластомы, а во-вторых, для включения клеток, полученных от пациента, для лучшего прогнозирования индивидуального ответа пациента. Для начала поместите строительные леса, хранящиеся в PBS, в ламинарный колпак. Стерильным пинцетом аккуратно приподнимите леску из угла и прижмите к боковой стенке, чтобы удалить излишки PBS.

Затем поместите каркас блестящим слоем вниз в центр лунки неприклеенной 24-луночной пластины. Подпишите табличку с подробными сведениями о клеточной линии, плотности посева и временных точках. Работайте с ячейками с одной плотностью посева за раз, а остальные клетки держите в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока они не будут готовы к использованию.

Для прикрепления клеток в каркасе используйте пипетку P20 со стерильными наконечниками, тщательно перемешайте клеточную суспензию и добавьте 20 микролитров соответствующей клеточной суспензии в центр каждого каркаса, следя за тем, чтобы клеточная суспензия оставалась на верхней части каркаса, а не на боковой стенке или дне лунки. Дайте клеткам прикрепиться в течение трех-пяти часов при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе и влажности 95%. В конце инкубации с помощью пипетки P1000 медленно добавьте один миллилитр предварительно подогретой питательной среды в каждую лунку, не допуская смещения каркасов, и инкубируйте планшет в течение ночи.

Наблюдайте за каркасами, первоначально, каждые два-три дня на предмет изменения цвета питательной среды по мере того, как клетки размножаются внутри каркаса. Используйте пистолет-дозатор объемом 10 миллилитров с медленным режимом, чтобы удалить и выбросить один миллилитр отработанной среды из лунки. Когда кондиционированная среда используется для эксперимента, соберите отработанную среду биологических репликатов в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и гранулируйте клеточный мусор центрифугированием.

Перелейте надосадочную жидкость в свежую пробирку и храните пробирку при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Установив пистолет-дозатор в режим капельного орошения, аккуратно добавьте в каркасы два миллилитра предварительно подогретой питательной среды. Инкубируйте планшет, содержащий каркас, и пополняйте свежую среду в течение желаемого периода роста, как показано на рисунке.

В ламинарном вытяжном шкафу стерилизуйте соответствующий реагент для анализа жизнеспособности клеток путем фильтрации через стерильный фильтр 0,2 микрометра в центрифужную пробирку. Подогрейте стерильный раствор, полную питательную среду и стерильный PBS на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия. Используя стерильный пинцет, перенесите каркасы для анализа в свежую 24-луночную чашку и пометьте планшет всеми соответствующими деталями.

Добавьте в каждую лунку по 900 микролитров предварительно подогретой питательной среды. Затем добавьте в каждую лунку по 100 микролитров реагента для определения жизнеспособности стерильных клеток. Для отрицательного контроля добавьте 900 микролитров среды и 100 микролитров реагента для определения жизнеспособности стерильных клеток в лунку без каркаса.

Закройте тарелку крышкой и осторожно покачайте ее в течение примерно трех минут, чтобы распределить разбавленный реагент для жизнеспособности клеток по всей лунке. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислого газа и влажности 95%. После извлечения тарелки из инкубатора осторожно покачайте ее в течение нескольких секунд и сгенерируйте тройки, как показано в текстовой рукописи.

Сгенерируйте технические трипликаты, перенеся 100 микролитров инкубируемой среды и реагента из одной лунки 24-луночной планшета в одну лунку полупрозрачной 96-луночной планшета, и выполните этот шаг в общей сложности три раза для одной лунки. Накройте 96-луночную пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить реагент для жизнеспособности клеток от света. Удалите и выбросьте оставшиеся 700 микролитров среды и реагента из скаффолдов в 24-луночном планшете.

Вымойте каждый каркас дважды одним миллилитром стерильного ПБС. Используйте микропланшетный ридер для измерения абсорбции на длинах волн 570 и 600 нанометров и рассчитайте процентное снижение жизнеспособности клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Статистический анализ результатов жизнеспособности клеток с помощью соответствующего программного обеспечения.

Введите значения биологических трипликатов, чтобы получить полосы погрешности и указать вариабельность анализа. Выполните односторонний дисперсионный анализ теста для изучения изменений жизнеспособности клеток в течение экспериментального периода времени с использованием соответствующего биостатистического программного обеспечения. Укажите существенные различия между временными точками на графиках, как описано в тексте рукописи.

Оценивали жизнеспособность двух клеточных линий нейробластомы, KellyLuc и IMR32, выращенных на скаффолдах. Увеличение плотности клеток привело к большему снижению жизнеспособности клеток с течением времени. Рост клеток на скаффолдах косвенно измерялся путем количественного определения ДНК, извлеченной из скаффолдов, и подсчитывалось количество клеток в образце.

Клетки IMR32 показали усиленный рост, а затем клетки KellyLuc со временем. Морфологию роста и распределение клеток на каркасах визуально оценивали с помощью гематоксилина, эозина и иммуногистохимического окрашивания. Клетки KellyCis83 росли быстрее и проникали глубже в оба состава каркаса, чем менее инвазивная клеточная линия Келли.

IMR32, выращенный на нано-гидроксиапатите, продемонстрировал контрастную картину роста с большими, плотно упакованными кластерами в течение 14 дней. Клеточно-специфические признаки контролировали с помощью иммуногистохимического окрашивания с последующим окрашиванием фаллоидином и DAPI, а обилие актина наблюдалось в клетках Kelly и KellyCis83 на коллаген-гликозаминогликанных скаффолдах. Для оценки клеточной активности in vitro измеряли секретируемые уровни хромогранина А, и клетки, выращенные на коллаген-гликозаминогликанах и коллагеновых нано-гидроксиапатитовых каркасах, продуцировали больше хромогранина А по сравнению с ростом на обычной 2D-культуре.

Химиорезистентная клеточная линия KellyCis83 секретировала больше хромогранина А, чем клеточная линия Келли. После прикрепления клеток клетки можно лечить различными терапевтическими средствами. Это дало бы более физиологически значимые результаты для реакции клеток на лекарства, чем обычная 2D-культура.

Этот метод позволяет исследователям лучше изучить, как ведут себя и реагируют раковые клетки на стимул в микроокружении опухоли, начиная от ответа на терапию или взаимодействия с другими типами клеток.