Одноклеточная характеристика притока кальция и инфекции ВИЧ-1 с использованием многопараметрической оптофлюидной платформы
18 мая 2021 г.
Здесь мы представляем протокол, в котором отдельные клетки контролируются на острые события и продуктивную инфекцию ВИЧ-1 на нанофлюидном устройстве. Данные визуализации определяют взаимодействие вируса и рецептора хозяина и динамику сигнального пути. Это первый метод нанофлюидной высокопроизводительной продольной одноклеточной культуры и визуализации для изучения кинетики передачи сигналов и молекулярных взаимодействий.
Этот протокол может захватывать кинетику в реальном времени на уровне одной клетки. Мы можем измерять отдельные параметры клеток в ответ на ВИЧ-инфекцию и связывать ранние сигнальные события с отсроченными этапами жизненного цикла вируса. Это интегрированная масштабируемая альтернатива традиционным методам визуализации с использованием новой оптофлюидной платформы для одноклеточной сортировки, культивирования, визуализации и автоматизации программного обеспечения.
Это первый установленный метод для нанофлюидной, высокопроизводительной, продольной одноклеточной культуры и визуализации. Этот метод может быть широко принят для изучения кинетики клеточной сигнализации и динамических молекулярных взаимодействий в различных болезненных состояниях. Визуальная демонстрация этого метода важна для передачи того, как проводится эксперимент, как ячейки оптически сортируются в ручки и как настраивать инфузии через чип.
Для начала приготовьте свежий раствор Fluo-4 AM, добавив 25 микролитров концентрированного моющего растворителя 100X и 2,5 микролитра 1, 000X Fluo-4 AM в 1,5 миллилитровую трубку, затем вихрь для смешивания. Пипетка 2,5 миллилитра питательной среды в загрузочный раствор и инвертируется для смешивания. Центрифугируют два миллиона ячеек МТ-4 в 500 раз G в течение трех минут, затем удаляют жижу и повторно суспендируют гранулу в двух миллилитрах подготовленного загрузочного раствора Fluo-4 AM.
Пипетка повторно подвешивает клетки в 35-миллиметровую чашку Петри. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15-30 минут, затем инкубировать еще 15-30 минут при комнатной температуре. Перенесите клеточную суспензию в трубку центрифуги и центрифугируют ячейки в 500 раз G в течение трех минут, затем удалите супернатант.
Повторно суспендируют гранулу клетки путем пипетки в одном миллилитрах питательной среды и центрифуги в 500 раз G в течение трех минут для промывки. Повторно суспендируют клеточную гранулу путем пипетки в культуральная среда в концентрации двух миллионов клеток на миллилитр в течение не менее 50 микролитров. Чтобы приготовить чип с смачивающим раствором, который облегчает выемку ячейки, загрузите трубки центрифуги, содержащие два миллилитра смачивающего раствора и 50 миллилитров деионизированной воды, на инструмент с новым оптофлюидным чипом и запустите функцию мокрого чипа, которая заположит чип смачивающим раствором.
Инкубируют чип при 50 градусах Цельсия и трижды промывайте чип водой. После промывки водой промывки промывки чипа тремя циклами по 250 микролитров питательной среды. Дополняйте клеточную суспензию с предыдущей ступени одним на 100 частей моющего средства F127 перед загрузкой, чтобы уменьшить вероятность прилипания клеток к каналам чипа.
Используйте иглу экспорта инструмента для импорта ячеек из 1,5-миллилитровой центрифужной трубки с операцией загрузки и импортом небольшого объема для пятимиллитрового пакета ячейки. Перьевые ячейки, использующие оптимизированное оптоэлектронное позиционирование или напряжение OEP 4,3 вольта и скорость клетки пять микрометров в секунду с помощью функции автоматического пера, которая автоматически обнаруживает отдельные ячейки, окружает их клеткой OEP и перемещает их в ближайшую ручку. Если интересующие ячейки остаются после автоматического написания, используйте функцию ручного пера для выбора целевых ячеек и целевого пера.
После завершения написания промывайте чип тремя циклами по 250 микролитров питательной среды, чтобы очистить оставшиеся неоткопимые клетки от чипа. После написания клеток получите флуоресцентные изображения клеток в каналах FITC, Texas Red и DAPI для измерения базового уровня Fluo-4, mCherry и автофлуоресценции. Вливать ВИЧ-1 в микрочип в концентрации 13 нанограммов ВИЧ-1 NLCI на два миллиона клеток, медленно пипетируя суспензию в чип через экспортную иглу.
Сразу после добавления ВИЧ-1 многократно получать изображения в каналах FITC и DAPI в течение 10-минутного временного курса. Получайте изображения в каналах Texas Red и DAPI через один, два, три и четыре дня после заражения. Эта методология использовалась для идентификации и кластеризации ВИЧ-инфицированных и неинфицированных клеток с помощью измерения mCherry.
Клетки с изменением сигнала mCherry больше или ниже средней интенсивности флуоресцентности 40 000 были сгруппированы в популяцию mCherry high или mCherry low соответственно. Эти кластеры были проанализированы на кинетику притока кальция путем измерения внутриклеточного кальция с использованием флуоресценции Fluo-4 многократно в течение девяти минут времени, что продемонстрировало ранний приток кальция в ВИЧ-инфицированные клетки. Наблюдалась значительная положительная корреляция между притоком кальция и цветением мвышни.
При попытке этой процедуры важно не забывать начинать с клеток в пределах экспоненциального диапазона роста как для производства вируса, так и для инфекции, потому что разросшиеся клетки приведут к резкому снижению сигнала от этого анализа. Работа с ВИЧ-1 может быть опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует принимать методы BSL-2, указанные в стандарте OSHA bloodborne Pathogen Standard.
Этот метод интересен, потому что он позволит нам изучать одноклеточные фенотипические или транскрипционные изменения в контролируемых условиях. Это имеет широкий потенциал для корреляции влияния стимулов на молекулярные пути во многих типах клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Данный протокол позволяет осуществлять мониторинг отдельных клеток в режиме реального времени в условиях острого заражения HIV-1 с использованием нанофлюидного устройства. Он позволяет наблюдать за взаимодействием вируса с рецепторами хозяина и динамикой сигнальных путей, что является значительным достижением в области культуры и визуализации отдельных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Вирусология
Теоретические основы
- Традиционные методы визуализации имеют ограничения при изучении ответов отдельных клеток.
- Понимание динамики инфекции HIV-1 имеет решающее значение для разработки терапевтических стратегий.
- Нанофлюидные устройства предлагают новый подход для высокопроизводительного анализа.
- Захват данных в реальном времени может углубить понимание кинетики клеточной сигнализации.
Цель исследования
- Разработать метод мониторинга ответов отдельных клеток на инфекцию HIV-1.
- Установить корреляцию между ранними событиями передачи сигнала и более поздними стадиями жизненного цикла вируса.
- Предложить масштабируемую альтернативу традиционным методам визуализации.
Используемые методы
- Оптофлюидная платформа для сортировки и культивирования отдельных клеток.
- Визуализация клеточных ответов в режиме реального времени.
- Программная автоматизация анализа данных.
- Лонгитюдное наблюдение за динамикой отдельных клеток.
Основные результаты
- Успешная регистрация кинетики в реальном времени на уровне отдельных клеток.
- Идентификация ранних событий сигналинга, связанных с ВИЧ-инфекцией.
- Демонстрация применимости метода при различных патологических состояниях.
- Визуальное представление схемы эксперимента облегчает понимание протокола.
Выводы
- Данный метод представляет собой прорыв в изучении клеточных взаимодействий при вирусных инфекциях.
- Он может быть широко применен для различных исследовательских задач в области клеточной биологии.
- В будущих исследованиях этот метод можно использовать для изучения механизмов других заболеваний.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данная оптофлюидная платформа позволяет в режиме реального времени с разрешением до одной клетки регистрировать события раннего инфицирования ВИЧ-1, в частности кинетику притока ионов кальция, связывая первичные взаимодействия вируса с хозяином с последующим продуктивным инфицированием. Путем корреляции транзиторных сигнальных событий с отложенными стадиями жизненного цикла вируса данный метод способствует механистическому снижению рисков при валидации мишеней противовирусных препаратов и разработке анализов. Благодаря масштабируемой автоматизированной конструкции платформа может использоваться как многократно применяемый инструмент для фенотипического скрининга и идентификации трансляционных биомаркеров в исследованиях по вирусологии и иммунологии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверить терапевтические гипотезы, связав раннюю передачу сигналов кальция с продуктивной инфекцией ВИЧ-1 с разрешением до одной клетки.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишеней посредством кинетической корреляции потока кальция и экспрессии репортера mCherry с течением времени.
- Прогностическая ценность: способствует приоритизации портфеля соединений путем выявления веществ, которые модулируют ранний приток кальция и снижают уровень инфицирования.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка валидированных биологических систем для высокопроизводительного скрининга посредством автоматизированной сортировки одиночных клеток, культивирования и лонгитюдной визуализации.
- Количественные результаты: Обеспечение воспроизводимых мультипараметрических показателей, включая поток ионов кальция (Fluo-4), статус инфицирования (mCherry) и базовую автофлуоресценцию (DAPI).
- Масштабируемость: Поддержка нанофлюидного удержания тысяч отдельных клеток на одном чипе, что обеспечивает статистическую значимость при изучении дозозависимых ответов и действии антагонистов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболевания: Моделирует ранние этапы проникновения ВИЧ-1 в линию Т-клеток человека (MT-4), обеспечивая релевантную системе заболевания модель для механистических исследований.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап фундаментальных открытий с доклиническими исследованиями, фиксируя динамику передачи сигналов, которая позволяет прогнозировать исходы инфекции.
- Соответствие биомаркерам: Позволяет идентифицировать ранние сигнальные признаки (например, пороги потока кальция), которые коррелируют с поздними стадиями репликации вируса.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в общий цикл разработки — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, обеспечивая динамический фенотипический анализ, который позволяет принимать решения о продолжении или прекращении разработки в рамках противовирусных программ.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез о взаимодействии вируса и хозяина путем измерения кинетики кальция в реальном времени после острого воздействия HIV-1.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость анализа за счет автоматизированного оптоэлектронного позиционирования и контроля условий окружающей среды непосредственно на чипе.
- Аналитика: позволяет проводить количественное сравнение условий инфицирования с помощью лонгитюдного отслеживания флуоресценции и кластеризации на основе пороговых значений интенсивности mCherry.
- Трансляционные исследования: связывает ранние события сигналинга с продуктивным инфицированием в течение 4 дней, что позволяет принимать обоснованные решения о продвижении исследований с учетом рисков.
- Корпоративное повторное использование: функционирует как платформенная технология, адаптируемая к другим вирусам, агонистам или антагонистам, помимо HIV-1.
Операционное и организационное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет установления временных взаимосвязей между ранней сигнализацией и вирусной репликацией.
- Операционная ценность: Обеспечивает воспроизводимость за счет автоматизированного внесения клеток, их локализации, визуализации и контроля условий окружающей среды.
- Стратегическая ценность: Улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя ранние прогностические биомаркеры восприимчивости к инфекции.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию ингибиторов проникновения или иммуномодуляторов на основе анализа рисков и модуляции потока ионов кальция.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с визуализацией живых клеток, оптофлюидными системами и флуоресцентной микроскопией.
- Зависит от совместимости нанофлюидного чипа с Fluo-4 AM, репортерными вирусами mCherry и культуральными средами.
- Необходима стандартизация напряжения удержания клеток (4.3V OEP), скорости перемещения ловушки (5 µm/s) и протоколов введения реагентов для всех пользователей.
- Требуется адаптация графиков дозирования агонистов/антагонистов в соответствии с 8-минутным окном визуализации кальция и 4-дневным периодом считывания после инфицирования.
- Метод ограничен адгезивными или полуадгезивными клетками, совместимыми с оптоэлектронным удержанием; для типов клеток, которые невозможно удерживать таким способом, может потребоваться модификация платформы.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:57
Preparation of Cells for Imaging
2:33
Optofluidic System Preparation, Cell Loading, and Cell Penning
4:27
Single-cell Infection and Functional Imaging
5:24
Results: Single-Cell Characterization of Calcium Influx and HIV-1 Infection
6:20
Conclusion
