Идентификация альтернативного сплайсинга и полиаденилирования в данных RNA-seq
24 июня 2021 г.
Альтернативное сплайсинг (AS) и альтернативное полиаденилирование (APA) расширяют разнообразие изоформ транскриптов и их продуктов. Здесь мы описываем биоинформационные протоколы для анализа объемных анализов РНК-seq и 3'-концевого секвенирования для обнаружения и визуализации AS и APA, варьирующихся в зависимости от экспериментальных условий.
Этот протокол обеспечивает всестороннее понимание изоформ генов, генерируемых альтернативным сплайсингом и полиаденилированием, предоставляя пошаговый рабочий процесс для идентификации дифференциальных сайтов сплайсинга, дифференциально экспрессированных экзонов и поли(А)сайтов. Основным преимуществом этого протокола является то, что он оценивает как экзонные, так и событийные методы изучения альтернативного сплайсинга. Он также применяет метод на основе экзонов для изучения альтернативного полиаденилирования.
Были предоставлены файлы R Markdown, содержащие коды и примечания для анализа AS и AP. Было бы целесообразно следовать шагам в файле R Markdown и тщательно добираться до примечания к каждому шагу. Чтобы определить дифференциальное сращивание с помощью diffSplice от limma, следуйте файлу записной книжки R.
Подготовьте входные файлы, как описано в текстовой рукописи. Убедитесь, что шаги с первого по третий в рукописи были выполнены последовательно для подготовки входных файлов, прежде чем продолжить работу. Начните с загрузки необходимых библиотек.
Чтобы выполнить неспецифическую фильтрацию, сначала извлеките матрицу счетчиков чтения, полученную ранее, и создайте список объектов с помощью функции DGEList из пакета edgeR, где строки представляют гены, а столбцы представляют образцы. Затем преобразуйте данные из необработанного масштаба в счетчики на миллион с помощью функции CPM из пакета edgeR и сохраните экзоны с количеством, превышающим заданное пороговое значение. Этот набор данных содержит шесть образцов.
Следовательно, CPM устанавливается на более чем один и, по крайней мере, три образца из шести. Нормализуйте счетчики между выборками с помощью функции calcNormFactors из пакета edgeR, используя усеченное среднее значение значений M. Эта функция вычисляет коэффициенты масштабирования для настройки размеров библиотек.
Используйте ранее созданную таблицу образцов для создания матрицы проектирования для определения экспериментальных условий для каждого образца. Запустите функцию voom пакета limma для обработки данных секвенирования РНК для оценки дисперсии. Эта функция будет генерировать прецизионные веса для исправления шума подсчета Пуассона и преобразования значений уровня экзона для регистрации двух подсчетов на миллион или logCPM.
Запустите функцию lmfit, чтобы привести линейные модели в соответствие с данными выражения для каждого экзона. Затем запустите функцию eBayes для вычисления эмпирической статистики для установленной модели для обнаружения дифференциального выражения экзона. Определите контрастную матрицу для экспериментальных сравнений, представляющих интерес.
Используйте контрасты. функция fit для получения коэффициентов и стандартных погрешностей для каждой пары сравнений. Запустите diffSplice на подходящей модели, чтобы проверить различия в использовании генов экзона между диким типом и нокаутом.
Изучите результаты с самым высоким рейтингом, используя функцию topSplice, где тест, равный t, дает рейтинг экзонов AS, а тест, равный simes, дает ранжирование генов. Запустите функцию plotSplice для построения результатов. Помещая интересующий ген в аргумент идентификатора гена, красные точки показывают дифференциально экспрессированные экзоны.
Сгенерируйте график вулкана, используя пакет биопроводников EnhancedVolcano для демонстрации дифференциально выраженных экзонов. Чтобы использовать rMATS, убедитесь, что последняя версия rMATS версии 4.1.1 установлена либо с помощью conda, либо GitHub в рабочем каталоге. Перейдите в папку, содержащую файлы bam, полученные после сопоставления.
Подготовьте текстовые файлы в соответствии с требованиями rMATS для двух условий копирования имени файлов bam и пути к ним, разделенные запятой. Запустите rmas. py с использованием двух сгенерированных входных текстовых файлов, описывающих путь к файлам bam и аннотацию.
gtf файл, полученный ранее. При этом создается выходная папка rmats_out содержащая текстовые файлы, описывающие статистику, включая P-значения и уровни включения для каждого события сплайсинга отдельно. Используйте биопроводниковый мазер для изучения результатов rMATS.
Загрузите в объект maser текстовые файлы с расширением JCEC соединения и exon count и включите не менее пяти средних считываний на событие сплайсинга, чтобы отфильтровать результат на основе покрытия. Чтобы визуализировать результаты rMATS, сначала запустите функцию topEvents из пакета масера, выбрав значимые события сплайсинга со скоростью ложного обнаружения 10% и минимальным изменением процента сращивания в или PSI. Проверьте события гена для отдельных генов, представляющих интерес, и постройте график значений PSI для каждого события сплайсинга этого гена.
Создайте график вулкана, указав тип события. Используйте результаты событий сплайсинга, полученные с помощью rMATS в виде текстовых файлов, для генерации графиков сашими с помощью пакета rmats2sashimiplot. График сашими показывает пропущенное событие экзона в гене Wnk1.
Каждая строка представляет собой образец RNA-seq, три реплики дикого типа и нокаут Mbnl1. Высота показывает покрытие считывания в RPKM, а соединительные дуги изображают считывание соединения между экзонами. В нижней части показаны аннотированные альтернативные изоформы модели генов.
Существенное изменение складки и убедительные статистические доказательства подлинных различий можно наблюдать в генах, расположенных в верхнем левом или правом квадрантах графиков вулканов, полученных с помощью diffSplice и DEXSeq. Было обнаружено, что кассетный экзон варьируется между различными условиями для гена Wnk1. График использования дифференциального экзона показал доказательства дифференциального сращивания на пяти участках экзонов вблизи Wnk1.6.45, причем экзоны, выделенные розовым цветом, вероятно, будут сращены в нокаут-образцах Mbnl1 по сравнению с диким типом.
Вулканический участок генов, которые альтернативно сращиваются, помог различить гены, которые были исключены из дикого типа, и те, которые были включены в дикий тип. Типы событий сплайсинга SE, A5SS, A3SS, MXE и RI были визуализированы с использованием графиков сашими главных значимых генов этих событий. Дифференциальная активность АПА в трех простых нетранслируемых областях генов наблюдалась с использованием вулканических графиков.
Значительно дифференцированные результаты использования сайта PA, полученные от разных конвейеров, были визуализированы с помощью графика событий. Значительный дистальный и проксимальный сдвиг использования сайта ПА в двойных нокаутах может наблюдаться как в генах FOSL1, так и в Papola. Среднее покрытие во фланговых областях, закрепленных на известных участках расщепления ПА на уровне всего генома, определяли с помощью диагностического участка.
Убедитесь, что параметры, такие как трансспецифическая информация и разрешение на множественное перекрытие, правильно используются при создании метрик счетчика. Линейная модель подгонки и генерация контрастных пар важна для правильного сравнения. Для rMATS убедитесь, что все параметры установлены правильно в соответствии с вашими данными, прежде чем выполнять команду.
Гены, полученные в результате дифференциальной сплайсинговой активности, могут быть использованы для проведения анализа обогащения набора генов. Другой инструмент под названием MISO может быть использован для дальнейшего анализа на основе событий.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование посвящено сложности альтернативного сплайсинга (АС) и альтернативной полиадениляции (АПА) в регуляции экспрессии генов. Используя биоинформационные протоколы для анализа данных секвенирования РНК, исследование подчеркивает преимущества как экзон-ориентированных, так и событий-ориентированных методов для обнаружения и визуализации альтернативного сплайсинга и полиадениляции в различных экспериментальных условиях.
Ключевые компоненты исследования
Область исследования
- Альтернативный сплайсинг
- Альтернативная полиадениляция
- Биоинформатика
Фон
- Увеличение разнообразия изоформ транскриптов
- Влияние на экспрессию генов
- Технологические достижения в секвенировании РНК
Использованные методы
- Биоинформационные протоколы для анализа RNA-seq
- Экзон-ориентированные и событий-ориентированные методы обнаружения
- Визуализация сайтов сплайсинга и событий полиадениляции
Основные результаты
- Идентификация дифференциальных сайтов сплайсинга и использования сайтов поли(А)
- Доказательства альтернативного сплайсинга и полиадениляции в различных экспериментальных условиях
- Успешная визуализация результатов с помощью графиков и биоинформационных выходов
Выводы
- Результаты демонстрируют значительное разнообразие АС и АПА в различных условиях.
- Эта работа способствует нашему пониманию разнообразия транскриптов и его последствий для биологических исследований.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Alternative splicing and polyadenylation analysis enables biopharma R&D teams to resolve isoform-specific regulatory mechanisms that are obscured at the gene-expression level. This mechanistic de-risking supports target validation by clarifying functional consequences of genetic perturbations and improving predictive confidence in lead identification. Integrating exon- and event-based RNA-seq workflows enhances assay readiness for downstream screening and translational biomarker development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by identifying differential exon usage and polyadenylation site shifts that reflect isoform-specific gene regulation.
- Operational Value: Apply exon-based methods to study alternative polyadenylation, enabling unified analysis of splicing and 3' end processing from a single RNA-seq dataset.
- Predictive Value: Detect cassette exon variations and distal-to-proximal polyadenylation shifts that inform functional target de-risking and portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generate quantitative exon-level and splicing-event readouts (e.g., percent spliced in, inclusion levels) suitable for high-resolution compound screening.
- Operational Value: Normalize and filter count data using edgeR and limma workflows to ensure reproducibility across replicates and conditions.
- Assay Readiness: Produce visualization-ready outputs such as volcano plots, sashimi plots, and event plots for cross-functional review of splicing and polyadenylation dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Link differential splicing and polyadenylation events to disease-relevant genes (e.g., Wnk1, FOSL1) observed in knockout models, supporting mechanistic continuity.
- Operational Value: Use rMATS and maser packages to filter significant splicing events by false discovery rate and percent spliced-in change, enabling robust biomarker candidate selection.
- Translational Value: Visualize isoform-specific expression changes via sashimi plots to support preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing isoform-resolution data that informs target validation, assay development, and mechanistic follow-up in lead optimization.
- Discovery Biology: Test hypotheses about isoform regulation by comparing exon usage and polyadenylation site distribution across genetic or pharmacological conditions.
- Screening: Generate standardized, quantitative exon and splicing event metrics that support reliable compound effect assessment in phenotypic or target-based assays.
- Analytics: Derive empirical statistics, p-values, and effect sizes from linear modeling (voom, lmfit, eBayes) and event-based tools (rMATS, diffSplice) to compare conditions objectively.
- Translational Research: Connect splicing and polyadenylation changes to gene-level phenotypes in preclinical models, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Deploy the R Markdown-based protocol as a reusable bioinformatics capability across projects studying genetic models, drug treatments, or disease tissues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduce mechanistic ambiguity by resolving isoform-specific regulatory layers missed in conventional gene-level differential expression analysis.
- Operational Value: Ensure reproducibility through standardized normalization (CPM, calcNormFactors), filtering thresholds, and validated Bioconductor packages (limma, edgeR, rMATS, maser).
- Strategic Value: Improve go/no-go decisions by providing early evidence of isoform-level target modulation, reducing late-stage biological attrition risk.
- Portfolio Impact: Enable risk-adjusted prioritization of targets based on concordant splicing and polyadenylation evidence across orthogonal methods (exon-based and event-based).
Implementation Considerations
- Requires bioinformatics expertise in RNA-seq analysis, linear modeling, and splicing event interpretation using R/Bioconductor.
- Dependent on aligned BAM files, gene annotation (GTF), and count matrices generated from standard RNA-seq preprocessing.
- Necessitates cross-team standardization of filtering criteria (e.g., CPM >1 in ≥3 samples) and statistical thresholds (FDR <0.1, ΔPSI ≥10%) for reproducible results.
- Involves adaptation of parameters (e.g., overlap settings, transpecific information) when applying count metrics to alternative splicing and polyadenylation pipelines.
- Includes practical limitations such as the need for sufficient sequencing depth to detect low-abundance isoforms and the importance of validating computational predictions with orthogonal methods (e.g., PCR, long-read sequencing).
