Оценка in vitro сердечного перепрограммирования путем измерения сердечного специфического потока кальция с помощью репортера GCaMP3
22 февраля 2022 г.
Здесь мы описываем создание и применение линии репортеров Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J (называемой αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) для оценки перепрограммирования сердца. Неонатальные сердечные фибробласты (NCF), выделенные из штамма мыши, превращаются в индуцированные кардиомиоциты (iCM), что позволяет удобно и эффективно оценивать эффективность перепрограммирования и функциональное созревание iCM через поток кальция (Ca2+).
Методы, описанные в этом протоколе, обеспечат ценную платформу для оценки функционального созревания МСМ для исследований сердечного перепрограммирования. Поток кальция наблюдается исключительно в МСМ и обеспечивает способ оценки функционального созревания ICM. Этот штамм мыши упрощает процедуры оценки и повышает воспроизводимость результатов.
Этот протокол является новым методом оценки функционального созревания МСМ в области перепрограммирования сердца. Он также может быть применен для оценки дифференцировки кардиомиоцитов и сердечной функции. Начните с получения от восьми до 10 детенышей, от P0 до P2, чтобы изолировать 10 миллионов неонатальных сердечных фибробластов или NCF.
Глубоко обезболивают детенышей путем переохлаждения. Наблюдайте за сердцами под флуоресцентным микроскопом, чтобы убедиться, что сердце с нужным генотипом показывает поток кальция, обозначенный GCaMP3 с бьющимися сердцами. Другие генотипы не будут проявлять флуоресценцию.
После изоляции сердец разрежьте их на четыре части, чтобы они были слабо связаны. Тщательно промойте их несколько раз в ледяном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco, или DPBS, в шестисантиметровой пластине, чтобы ограничить загрязнение клеток крови в изолированных клетках. Переваривайте сердца восемью миллилитрами теплого 0,25%трипсина-ЭДТА в 37 градусах Цельсия в течение 10 минут.
Откажитесь от супернатанта трипсина и добавьте пять миллилитров по 0,5 миллиграмма на миллилитр теплой коллагеназы второго типа в сбалансированный солевой раствор Хэнка. Тщательно вихрьте смесь и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение пяти минут. После инкубации снова тщательно вихрьте смесь и дайте непереваренной ткани осесть под действием силы тяжести.
Соберите супернатант в 15-миллилитровую коническую трубку с пятью миллилитрами холодной среды фибробластов. Разбавьте клетки средой фибробластов таким образом, чтобы плотность посева составляла от двух до 2,5 раз 10-четвертых клеток на кубический сантиметр. Затем посейте клетки в посуде или тарелках.
Прикрепленные фибробласты должны иметь овальную или круглую форму на второй день после посева. На нулевой день засейте NCF до плотности примерно от одного до двух раз от 10 до четвертой клетки на кубический сантиметр в среде фибробластов. В первый день замените культуральную среду вирусосодержащей средой для каждой скважины по желанию.
На 2-й день, через 24 часа после заражения вирусом, замените вируссодержащую среду обычной средой ICM. Оцените поток ионов кальция с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа при комнатной температуре. Наблюдайте за положительными клетками GCaMP3 под объективом 10X, гарантируя, что он показывает спонтанные клетки, бьющиеся в канале яркого поля.
Сердца с правильным генотипом показали поток ионов кальция, синхронизированный с биением, визуализированный как флуресценция GCaMP3. При этом флуоресценции в контрольных сердцах не наблюдалось. Изолированные НКФ прикреплялись к колодцу в течение двух часов и показывали овальную или круглую форму через день после посева.
Колебание ионов кальция показало изменение флуоресценции GCaMP3 между максимальным и минимальным, а колебания ионов кальция таких клеток периодически менялись. После введения IMAP количество бьющихся кластеров было значительно выше, чем в контролируемой группе, поскольку количество положительных клеток GCaMP3 с потоком ионов кальция для поля высокой мощности было увеличено в группе, обработанной средой IMAP. НПФ должны быть свежеприготовленными и здоровыми после изоляции.
Быстрая процедура изоляции сердца, разрезания и правильного времени пищеварения может помочь избежать снижения жизнеспособности и состояния клеток. Этот метод обеспечивает способ идентификации функциональных созревших МСМ для исследователей сердечного перепрограммирования. С помощью нескольких дополнительных методов оценки можно получить более краткое представление о функциональных созревших МСБ.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена новая линия мышей-репортеров αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, предназначенная для оценки кардиального перепрограммирования. Разработанный протокол позволяет оценивать индуцированные кардиомиоциты (iCMs), полученные из неонатальных кардиальных фибробластов (NCFs), посредством анализа потока ионов кальция.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Кардиальное репрограммирование
- Индуцированные кардиомиоциты
- Анализ потока кальция
Теоретическая база
- Мышиная модель αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 упрощает проведение исследований сердца.
- Неонатальные кардиальные фибробласты могут быть эффективно преобразованы в иКМ.
- Поток ионов кальция служит ключевым индикатором функционального созревания иКМ.
- Данный метод повышает воспроизводимость исследований в области репрограммирования сердца.
Цель исследования
- Создание надежной платформы для оценки функционального созревания iCM.
- Упрощение процедур оценки в исследованиях по кардиальному репрограммированию.
- Получение данных о дифференцировке кардиомиоцитов и функции сердца.
Используемые методы
- Выделение сердечных фибробластов новорожденных мышей (NCFs) из щенков от P0 до P2.
- Превращение NCFs в индуцированные кардиомиоциты.
- Оценка функционального созревания с помощью измерения потока ионов кальция.
- Оценка эффективности репрограммирования и сердечной функции.
Основные результаты
- Успешная конверсия NCF в функциональные iCM.
- Поток кальция, наблюдаемый исключительно в iCM, свидетельствует о созревании.
- Повышенная воспроизводимость результатов в исследованиях репрограммирования сердца.
- Протокол применим для оценки дифференцировки кардиомиоцитов.
Выводы
- Мышиная модель αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 является ценным инструментом.
- Анализ потока ионов кальция эффективен для оценки созревания iCM.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области перепрограммирования и функции сердечной ткани.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оценка функционального созревания индуцированных кардиомиоцитов остается критическим узким местом в кардиальном репрограммировании для регенеративной терапии. Данный протокол обеспечивает прямой считываемый с помощью репортера сигнал потока ионов кальция, что позволяет объективно оценить функциональную зрелость iCM, поддерживая валидацию мишеней и снижение механистических рисков на ранних этапах поиска. Связывая транскрипционное репрограммирование с функциональным электрофизиологическим результатом, этот метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей и обосновывает решения по выбору стратегий восстановления сердца.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы, связывая доставку факторов транскрипции (MGT) с функциональными показателями переходных процессов кальция в репрограммированных клетках.
- Практическая ценность: использование флуоресценции GCaMP3 позволяет изолировать успешно репрограммированные iCM, снижая зависимость от косвенных маркеров, таких как экспрессия генов.
- Прогностическая ценность: поток ионов кальция служит функциональным биомаркером, который способствует биологическому снижению рисков и повышает уверенность в выборе мишени при подходах к кардиальному репрограммированию.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создается стандартизированная платформа на основе флуоресценции для количественного определения потока ионов кальция в качестве количественной зависимой переменной в анализах созревания iCM.
- Воспроизводимость: Линия мышей-репортеров обеспечивает стабильное обнаружение функциональных iCM в различных экспериментах, что способствует стандартизации анализа.
- Масштабируемость: Метод совместим с флуоресцентной микроскопией и может быть адаптирован к высокопроизводительным системам визуализации для скрининга эффективности репрограммирования.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: обеспечивает релевантную заболеванию систему для оценки функционального созревания iCM in vitro, связывая этап открытия с доклинической валидацией.
- Трансляционная непрерывность: позволяет проводить лонгитюдную оценку созревания iCM от ранних стадий репрограммирования до достижения функциональной электрофизиологической компетенции.
- Снижение механистических рисков: измерения потока ионов кальция помогают отличить структурно репрограммированные клетки от функционально зрелых iCM, снижая количество ложноположительных результатов.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум открытий — от валидации мишени через идентификацию соединений-лидеров до доклинической оценки, обеспечивая, в частности, возможность функционального анализа после транскрипционного репрограммирования, но до валидации in vivo.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез, позволяя определить, индуцируют ли факторы репрограммирования не только экспрессию маркеров, но и функциональный транспорт кальция.
- Скрининг: обеспечивает создание готовых к анализу воспроизводимых биологических систем с количественным определением потоков кальция для сравнения соединений или условий.
- Аналитика: позволяет получать временные данные на основе флуоресценции о частоте и амплитуде осцилляций кальция, что обеспечивает возможность статистического сравнения условий репрограммирования.
- Трансляционные исследования: связывает результаты репрограммирования in vitro с функциональными фенотипами кардиомиоцитов, имеющими значение для доклинических моделей.
- Повторное использование в масштабах предприятия: создает универсальную репортерную платформу, применимую к различным мишеням кардиального репрограммирования и протоколам дифференцировки.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прямое измерение функционального созревания, снижая механистическую неопределенность в результатах репрограммирования.
- Операционная ценность: повышает стандартизацию и воспроизводимость за счет специфичности генетического репортера, сводя к минимуму вариабельность, характерную для методов на основе антител.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении исследований, связывая молекулярное репрограммирование с функциональной электрофизиологической готовностью.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию стратегий репрограммирования с учетом рисков на основе выхода функциональных iCM и качества их созревания.
Особенности реализации
- Требуется опыт в разведении мышей, изоляции тканей сердца и флуоресцентной микроскопии.
- Зависит от наличия доступа к линии мышей αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 и вирусным системам доставки для MGT.
- Необходимы стандартизированные условия культивирования и соблюдение временных рамок для обеспечения стабильной индукции iCM и оценки потока ионов кальция.
- Адаптация к альтернативным источникам фибробластов или другим видам может потребовать подтверждения специфичности репортера и достоверности передачи кальциевых сигналов.
- Практические ограничения включают зависимость визуализации потока от спонтанных сокращений и возможную вариабельность эффективности трансфекции.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
