AAV Развертывание конструктов экспрессии на основе энхансеров In Vivo в мозге мыши
31 марта 2022 г.
Этот протокол описывает новый анализ переходного энхансера-репортера на основе rAAV. Этот анализ может быть использован для индуцирования экспрессии in vivo, управляемой энхансерами, в мозге мыши.
Этот протокол важен, потому что он позволяет визуализировать не только то, может ли последовательность усилителя управлять экспрессией, но и то, где она может управлять экспрессией в определенной части тела. Это быстро. Инъекции занимают менее 10 минут, а экспрессируется ли и где экспрессируется ген репортера, можно увидеть всего за несколько дней после сбора образца.
Чтобы начать клонирование, выберите или спроектируйте конструкцию репортера. Конструкция, используемая здесь, помещает кандидата на энхансер в три основные непереведенные области репортерского гена EGFP, экспрессируемого под контролем минимального промотора hsp68. Чтобы спроектировать праймеры ПЦР для усиления интересующей последовательности и клонирования в вектор, добавьте соответствующий гомологический рычаг для клонирования Гибсона к пяти основным концам праймеров.
Используя разработанные праймеры, выполните ПЦР из образца ДНК. Переваривайте от одного до 10 микрограммов векторной ДНК с помощью Pac1 и Asc1, в зависимости от желаемого количества необходимых реакций клонирования. Используя электрофорез от 0,7 до 1% геля в течение 30-60 минут при 100 вольтах, отделите фрагменты рестрикции переваривания.
Извлеките полосу для линеаризованного вектора и очистите ее с помощью коммерческого набора для экстракции геля. Как только клонирование Гибсона и трансформация клеток завершены, помечайте клетки на селективные среды и инкубируйте в течение ночи при 37 градусах Цельсия. После проверки успешного клонирования конструкции репортера привите пять миллилитров закваски с использованием глицеринового запаса.
Выращивайте культуру в течение восьми-16 часов в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Когда бульон станет мутным, разбавьте заквасочную культуру в 1000 раз в 250-300 миллилитрах свежего селективного бульона LB и высиживайте его на ночь в встряхивающемся инкубаторе при 30 градусах Цельсия и 180 оборотах в минуту. Используя коммерческий плазмидный макси-набор, очистите плазмиду.
Чтобы проверить рекомбинацию ITR, выполните переваривание Xma1. Визуализируйте полосы. Убедитесь, что ваш дайджест показывает ожидаемое количество полос.
Рекомбинация приведет к меньшему количеству полос, чем ожидалось. Готовят к поставке рекомбинантную смесь ААВ. При сравнении паттернов экспрессии нескольких вирусов-репортеров энхансеров разбавьте каждый вирус, чтобы приравнять титры вируса к наименее концентрированному вирусу.
Смешайте энхансерный репортерный вирус и конститутивно экспрессируемый контрольный репортерный вирус в соотношении два к одному или три к одному. Добавьте небольшое количество быстрого зеленого красителя с конечной концентрацией 0,06% Разбейте кончик вытянутой стеклянной пипетки, изготовленной из капиллярной трубки с микролитровой градуировкой, аккуратно проткнув ее в нежную, безворсовую салфетку. Вставьте пипетку в аспираторный узел с помощью устройства для подачи давления, соединенного с резиновой прокладкой для удержания микрокапиллярной пипетки.
Втяните небольшой объем от 0,2 до 0,5 микролитра минерального масла в пипетку, применяя отрицательное давление через аспиратор. Держите аспиратор в стороне и поместите вирус на лед, пока он не будет готов к инъекции. После криоанестезирования неонатальных мышей примените отрицательное давление с помощью аспиратора в сборе и втяните вирусную смесь в вытянутую стеклянную пипетку, пока мениск не пройдет отметку в два микролитра.
Выньте мышь из холодной камеры и поместите ее на столешницу. Найдите места двусторонней инъекции на полпути между лямбдой и брегмой, а также сагиттальный шов и каждый глаз. Продезинфицируйте их с помощью спиртовой салфетки.
Проткните череп неонатальных мышей с помощью вытянутой стеклянной пипетки. Когда игла входит в череп, приложите положительное давление через аспираторный узел. Распределите один микролитр вируса в боковой желудочек и извлеките пипетку.
Поместите мышь на грелку или согревающую камеру для восстановления. Верните животное в домашнюю клетку после пробуждения. Записывайте флуоресцентные изображения, проходящие через участок мозга, используя 5-кратную субъективную линзу с низким увеличением.
Определив место инъекции, оцените степень трансдукции вируса в зависимости от плотности и интенсивности красных флуоресцентных клеток. Сравните животных, которые были трансдуцированы аналогичным образом. Записывайте флуоресцентные изображения с объективом с более высоким увеличением более чем в 25 раз.
Затем откройте программное обеспечение для анализа и примените медианный фильтр «три на три» для снижения шума. Нажмите на меню «Процесс», затем нажмите «Шум» и выберите опцию «Деспекл». Далее, чтобы вычесть фоновую флуоресценцию из изображений, начните с разделения каналов многоканального изображения.
Нажмите на меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите опцию «Разделить каналы». С помощью инструмента выделения «Прямоугольник» или «Круг» нарисуйте небольшую фигуру в области изображения без флуоресцентных ячеек. Измерьте среднюю интенсивность пикселей фона, щелкнув «Анализировать», а затем «Измерить», и повторите выборку несколько раз.
Усредните среднее значение серого цвета от пяти до восьми фоновых областей и удалите десятичные значения. Вычтите значения из каждого пикселя изображения, выбрав меню «Процесс», затем выберите «Математика и вычитание». Затем введите фоновое значение для вычитания и нажмите кнопку ОК. При необходимости объедините каналы обратно в многоканальное изображение, выбрав меню «Изображение», затем нажмите «Цвет» и выберите «Объединить каналы».
Чтобы подсчитать количество зеленых флуоресцентных клеток, скройте зеленый канал и нарисуйте форму вокруг области мозга, выражающую красную флуоресценцию, с помощью инструмента выделения свободной формы. Нажмите на функцию Измерить, чтобы измерить площадь, интегрированную плотность и среднее значение серого красного канала в выбранной зоне. Подсчитайте количество зеленых ячеек с помощью инструмента многоточечного выделения и нормализуйте количество зеленых ячеек по интегральной интенсивности красного канала.
После трансдукции репортера энхансера, который мышь вводила интракрационно в P0 с положительной конструкцией AAV, показал экспрессию EGFP, управляемую энхансером, в средних нижних слоях коры через 28 дней после инъекции. Мышь, которой вводили отрицательную контрольную конструкцию при P0, не показывает никакой экспрессии EGFP через 28 дней после инъекции, демонстрируя, что энхансерные элементы управляют транскрипцией EGFP в мозге мыши. Для визуализации успешно трансдуцированной области и контроля потенциальной изменчивости были исследованы библиотеки репортеров усилителей AAV различных титров.
Библиотека усилителей-кандидатов с высоким титром обеспечивает широкую экспрессию EGFP, в то время как библиотека усилителей-кандидатов с более низким титром стимулирует разреженную экспрессию CGFP в мозге мыши P7. Очень важно смешивать репортер энхансера AAV с положительным контролем при каждой инъекции, чтобы различать энхансеры без активности и неудачные роды. Эта процедура может быть сопряжена с иммуногистохимией, РНК FISH или секвенированием одноклеточной РНК, чтобы определить, в каких типах клеток активен энхансер.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Это исследование представляет новый временный анализатор-репортер на основе рААВ для in vivo использования в мозге мыши для визуализации экспрессии генов, управляемой энхансерами. Протокол позволяет исследователям быстро оценить не только то, может ли энхансер стимулировать экспрессию, но и где он может это делать в специфических областях мозга.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Экспрессия генов
- Молекулярная биология
Фон
- Понимание последовательностей энхансеров важно для расшифровки регуляции генов.
- In vivo модели предоставляют представление о паттернах экспрессии в специфических тканях.
- Этот метод позволяет быстро оценить активность генов по сравнению с традиционными подходами.
Цель исследования
- Создать эффективный анализатор для визуализации активности энхансеров в живом организме.
- Обеспечить быструю оценку экспрессии гена-репортера в мозге мыши.
- Позволить точную локализацию экспрессии, управляемой энхансерами.
Используемые методы
- Протокол использует подход трансдукции на основе рААВ.
- Модели мозга мыши используются для оценки паттернов экспрессии после вирусной доставки.
- Ключевые шаги включают клонирование конструкций репортера и проведение in vivo инъекций.
- Анализ паттернов экспрессии генов проводится всего через несколько дней после инъекции.
Основные результаты
- Успешная визуализация экспрессии EGFP, управляемой энхансерами, в специфических кортикальных слоях.
- Ясное различие между эффектами конструкций положительного и отрицательного контроля.
- Валидация паттернов экспрессии указывает на эффективную оценку активности энхансеров.
Выводы
- Этот протокол демонстрирует новый метод для оценки функции энхансеров in vivo.
- Позволяет быструю и локализованную оценку экспрессии генов, улучшая наше понимание регуляторных механизмов.
- Подход является ценным для будущих исследований, изучающих регуляцию генов в нейронных контекстах.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, in vivo assessment of enhancer activity in the mouse brain, providing spatial and temporal resolution of gene regulation without requiring transgenic models. It supports target validation by linking non-coding DNA elements to functional expression patterns in disease-relevant neural circuits. The approach accelerates mechanistic de-risking in early discovery by delivering quantitative, imaging-based readouts of enhancer function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by testing whether candidate enhancer sequences can drive gene expression in specific brain regions.
- Operational Value: Uses standard cloning and AAV packaging to generate enhancer-reporter libraries for high-throughput screening of regulatory elements.
- Predictive Value: Enables biological de-risking by linking enhancer activity to cell-type-specific expression patterns in the cortex and other neural structures.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantitative fluorescence readouts (EGFP intensity) that correlate with enhancer strength and activity patterns across developmental stages.
- Operational Value: Leverages expanding AAV serotypes and standardized imaging workflows for reproducible, scalable enhancer testing across multiple constructs.
- Assay Readiness: Generates validated biological systems (transduced mouse brain) suitable for downstream applications like immunohistochemistry or single-cell RNA sequencing to define enhancer-active cell types.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by mapping enhancer activity to specific cortical layers and developmental timepoints (P0 to P7).
- Translational Continuity: Enables cross-functional collaboration by providing standardized, spatially resolved expression data that can inform biomarker alignment and target selection.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by distinguishing active enhancers from negative controls through normalized green-to-red fluorescence ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling hypothesis testing of non-coding regulatory elements prior to lead identification and preclinical validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing where enhancers drive expression in the mouse brain, linking genotype to phenotype in neural tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized virus production, equitized titers, and co-injection with control reporters to distinguish true enhancer activity from delivery failure.
- Analytics: Enables quantitative comparison of enhancer activity via integrated density measurements and background-subtracted fluorescence imaging.
- Translational Research: Connects to preclinical work by allowing follow-up with RNA FISH or immunohistochemistry to determine cell-type specificity of enhancer-driven expression.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for enhancer library screening, leveraging low-cost AAV production and standard microscopy for repeated campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in enhancer function through direct in vivo visualization.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via controlled virus titers, background subtraction protocols, and normalized cell counting.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid screening of enhancer candidates without generating and maintaining transgenic lines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing clear, imaging-based evidence of enhancer activity in disease-relevant brain regions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise for Gibson assembly and viral vector preparation.
- Depends on AAV purification and titration infrastructure for consistent enhancer-reporter delivery.
- Necessitates stereotaxic injection skills and neonatal mouse handling for accurate intracranial delivery.
- Relies on fluorescence microscopy and image analysis tools (e.g., background subtraction, channel splitting) for reliable readout.
- Limited by enhancer context-dependency; activity may vary across developmental stages, brain regions, or disease models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
