Использование флуоресценции с временным разрешением, вызванного белком, для идентификации стабильных локальных конформаций по одному мономеру синуклеина α за раз
30 мая 2021 г.
Усиление флуоресценции с одномолекулярным белком, индуцированным временем, является полезным флуоресцентным спектроскопическим датчиком приближения, чувствительным к локальным структурным изменениям в белках. Здесь мы показываем, что он может быть использован для выявления стабильных локальных конформаций в α-синуклеине, который иначе известен как глобулярно неструктурированный и нестабильный при измерении с использованием линейки FRET с более длинным диапазоном.
Одномолекулярное, вызванное белком усиление флуоресценции может дополнять одномолекулярные измерения FRET при изучении структурных субпопуляций и конформаций белка, особенно в тех случаях, когда различные структурные субпопуляции сообщают о стабильных местных структурах. Основным преимуществом этого метода является то, что он захватывает различные структурные субпунции, специфичные для сайта, основанные на близости участка маркировки красителя к поверхностям белка. Одномолекулярное, вызванное белком флуоресцентное усиление может быть применено к любой биомолекулярной системе, представляющим интерес, для исследования различных, локальных, структурных субпопуляций.
Начните с получения 25 пикомоляров сульфо-Cy3-меченого альфа-синуклеина в измерительном буфере в трубке с низким содержанием белка. Добавьте 100 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр BSA к слайду крышки 18-камерной микроскопии и высиживайте в течение одной минуты, затем выбросьте BSA. Добавьте 100 микролитров 25 пикомолярных образцов альфа-синуклеина, меченых сульфо-Cy3, в камеру слайда крышки.
Затем для сбора данных добавьте каплю сверхчистой воды на верхнюю часть объектива с высокой числовой диафрагмой, зафиксируйте скользящий слайд крышки в камере сцены, а затем установите узел на верхнюю часть ступени микроскопа. Поднесите объектив вверх до тех пор, пока капля воды сверху объектива не смазывается в нижней части скользящего слайда крышки, и откройте лазерный затвор. Когда объектив сместится вверх, осмотрите рисунок воздушных колец на ПЗС-камере.
Первое кольцо представляет фокус на границе раздела вода/стекло, а второе кольцо представляет фокус на границе раздела между стеклом и раствором образца. Увеличьте высоту объектива на 75 микрометров, чтобы лазерный фокус был глубоко погружен в раствор для минимизации автофлуоресценции от стеклянной поверхности скольжения крышки. Настройте мощность лазера на объективе приблизительно 100 микроватт.
Начните сбор обнаруженных фотонов на заранее определенное время. Откройте записные книжки Jupyter, затем откройте образец записной книжки. Загрузите файл данных FRETBursts и Photon-HDF5.
Используйте гистограмму межфотонного времени для расчета фоновых частот за каждые 30 секунд сбора данных. Переместите временное окно из одного фотона за раз для 20 последовательных фотонов и соберите данные фотонов, если мгновенная частота фотонов F по крайней мере в 11 раз больше фоновой скорости за этот период сбора данных. Рассчитайте размер и количество фотонов в всплеске, продолжительность всплеска, разницу во времени между временем обнаружения последнего и первого фотона в всплеске, яркость всплеска, наибольшее значение мгновенной скорости фотона во всплеске и разделение всплесков, временной интервал между последовательными всплесками.
Построение гистограммы значений яркости серийной очереди с осью событий в логарифмической шкале. Определите порог яркости серийной очереди как минимальное значение яркости всплеска, из которого гистограмма демонстрирует затухающий паттерн, и выберите всплески со значениями яркости, превышающими порог яркости серийной очереди. Для измерения времени жизни средней флуоресценции всплеска построим гистограмму фотонового нановремени для всех фотонов в выбранных всплесках с осью подсчета фотонов в логарифмической шкале.
Определите порог нановрема как минимальное значение нановремени, из которого гистограмма фотоновых нановрейм демонстрирует паттерн распада. Выбирайте только те фотоны, у кого нановремя больше порога нановрем. Рассчитайте алгебраическое среднее всех выбранных фотонов нановремен.
Вычтите порог нановрема из среднего алгебраического значения фотона нановремени. Полученное значение представляет собой среднее фотонное нановремя всплеска, прямо пропорциональное среднему времени жизни флуоресценции. Построй гистограмму всех средних сроков жизни флуоресценции всплеска.
Могут появиться централизованно распределенные субпопуляции времени флуоресценции. Субпопуляции с более низкими средними значениями представляют собой молекулярные виды с Sulfo-Cy3, которые не были стерически затруднены, в то время как субпопуляции с более высокими средними значениями представляют собой молекулярные виды с S-Cy3, которые были более стерически затруднены. Для медленной оценки динамики между всплесками постройте гистограмму времени разделения разрывов с осью времени разделения в логарифмической шкале.
Выберите, чтобы сохранить все пары последовательных всплесков, которые разделены временем, меньшим, чем максимальное время разделения, определяемое субпопуляцию одной и той же молекулы. Постройте гистограмму или диаграмму рассеяния среднего времени жизни флуоресценции первого и второго всплесков для всех пар всплесков, которые повторялись ниже определенного порога времени разделения. Гистограммы среднего времени жизни флуоресценции одной, меченной S-Cy3, молекулы альфа-синуклеина-56 показали, что первая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 1,6 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с небольшим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56.
Вторая субпопуляция имела характерное время жизни флуоресценции 3,5 наносекунды и представляла собой альфа-синуклеиновые конформационные состояния с большим количеством белковых поверхностей в окрестностях остатка 56. Известно, что неамилоидные бета-компонентные сегменты молекул альфа-синуклеина принимают спиральную структуру шпильки при связывании с везикулами SDS, что было подтверждено как популяция одного срока жизни флоры с характерным сроком жизни примерно три наносекунды и отсутствием субпопуляции с характерным сроком жизни 1,6 наносекунды. Гистограмма времени разделения между последовательными одномолекулярными всплесками сообщает о повторяющихся молекулах для времени разделения быстрее 100 миллисекунд, где первый и второй всплески возникают из одной и той же молекулы.
Гистограмма среднего времени жизни флуоресценции всех одиночных молекул-всплесков показала субпопуляции с коротким характерным временем жизни, а также с длительным характерным временем жизни, что указывает на то, что отдельные молекулы могут подвергаться переходам между различными средними значениями времени жизни медленнее, чем время продолжительности всплеска. В течение времени разделения всплесков не более 100 миллисекунд была доля молекул, которые начинались как первый всплеск в субпопуляции с коротким сроком службы и повторялись как второй всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы. В то время как доля молекул, которая началась как первый всплеск в субпопуляции с длительным сроком службы и повторилась как второй всплеск в популяции с коротким сроком службы, указывает на переходы между двумя субпопуляциями в течение 10-100 миллисекунд.
Самое главное, что нужно помнить при анализе результатов экспериментов, это правильно отделить одномолекулярные флуоресцентные сигналы от фона и проанализировать всплески с достаточным количеством фотон нановрем. Разработка smPIFE проложила путь для исследователей для изучения белковых взаимодействий нуклеиновых кислот на уровне одной молекулы. Это достижение закладывает основу для изучения локальной структурной динамики внутри белков.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье рассматривается применение метода время-разрешенного одномолекулярного усиления флуоресценции, индуцированного белком, в качестве сенсора близости для обнаружения локальных структурных изменений в белках. В частности, освещается использование этого метода для выявления стабильных локальных конформаций в α-Synuclein — белке, известном своей глобулярно неупорядоченной структурой.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Биофизика
- Динамика белков
Теоретические основы
- Методы анализа единичных молекул позволяют получить представление о конформациях белков.
- α-Синуклеин связан с нейродегенеративными заболеваниями.
- Понимание его структуры имеет решающее значение для разработки терапевтических средств.
- Методы усиления флуоресценции могут выявить локальные структурные особенности.
Цель исследования
- Продемонстрировать эффективность усиления флуоресценции при изучении конформаций белков.
- Идентифицировать стабильные локальные конформации в α-Synuclein.
- Предложить метод, дополняющий существующие подходы, такие как FRET.
Используемые методы
- Приготовление образцов α-синуклеина, меченных Sulfo-Cy3.
- Использование пробирок с низкой адсорбцией белков для подготовки образцов.
- Применение BSA для снижения неспецифического связывания во время измерений.
- Методы микроскопии для визуализации усиления флуоресценции.
Основные результаты
- Усиление флуоресценции позволило успешно идентифицировать отдельные структурные субпопуляции.
- Были выявлены стабильные локальные конформации α-Synuclein.
- Метод оказался эффективным для получения сайт-специфической структурной информации.
- Результаты подтверждают полезность данного метода при изучении различных биомолекулярных систем.
Выводы
- Флуоресцентное усиление одиночных молекул с временным разрешением является мощным инструментом для анализа белков.
- Оно позволяет выявить стабильные конформации, которые невозможно обнаружить традиционными методами.
- Данный метод находит широкое применение в изучении динамики и взаимодействий белков.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Метод времяразрешенного одномолекулярного усиления флуоресценции, индуцированного белком (smPIFE), позволяет обнаруживать стабильные локальные конформации в белках с внутренним неупорядочением, таких как α-synuclein, которые часто не выявляются при использовании ансамблевых методов или методов на основе FRET. Разрешая субмиллисекундную динамику и сайт-специфическую структурную гетерогенность, smPIFE способствует валидации мишеней и снижению механистических рисков в исследованиях нейродегенеративных заболеваний. Данный подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет выявления переходных, но стабильных структурных состояний, которые могут служить доступными для воздействия лекарственных средств интерфейсами или биомаркерами.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет определить стабильные локальные конформации мономера α-synuclein, что дает возможность проверить терапевтические гипотезы о взаимосвязи структуры и функции разупорядоченных белков.
- Практическая ценность: Обеспечивает сайт-специфическое структурное разрешение с помощью измерений времени жизни флуоресценции при сближении красителя с белком, что дополняет глобальные данные о расстояниях, полученные методом FRET.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Позволяет разделять отдельные субпопуляции по времени жизни флуоресценции, соответствующие различным локальным структурным состояниям α-synuclein, что обеспечивает количественную дискриминацию конформационных субпопуляций.
- Практическая ценность: Позволяет получать данные в виде гистограмм среднего времени жизни флуоресценции вспышек, которые можно фильтровать по пороговым значениям и отбирать для дальнейшего анализа, что способствует стандартизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Позволяет обнаруживать взаимопревращения между структурными субпопуляциями на временных масштабах 10-100 ms, что дает данные для кинетических моделей динамики α-synuclein, имеющих значение для агрегации и связывания с мембранами.
- Практическая ценность: Использует анализ разделения вспышек для корреляции конформационных состояний с молекулярным повторением, что позволяет наблюдать динамику одной и той же молекулы во времени.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод smPIFE вписывается в континуум процесса поиска лекарственных средств — от проверки гипотезы о мишени до идентификации ведущих соединений, предоставляя данные о конформации конкретных участков, которые углубляют механистическое понимание роли α-synuclein в моделях нейродегенеративных заболеваний.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез, выявляя стабильные локальные конформации α-synuclein, которые не видны методом FRET из-за ограничения его диапазона 3-10 nm.
- Скрининг: позволяет подготовить анализ с помощью количественных гистограмм времени жизни флуоресценции, которые разделяют субпопуляции на основе стерического затруднения красителя вблизи остатка 56.
- Аналитика: обеспечивает измерение среднего времени жизни флуоресценции на основе наносекундных гистограмм фотонов, которое прямо пропорционально локальным взаимодействиям красителя с окружающей средой.
- Трансляционные исследования: подтверждают доклиническую значимость, показывая, что при связывании с SDS α-synuclein принимает структуру спиральной шпильки, что фиксируется как отдельная популяция по времени жизни (~3 ns).
- Повторное использование в индустрии: метод применим к любой биомолекулярной системе для исследования локальных структурных субпопуляций, что делает его универсальной платформой для динамического анализа белков.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет обнаружения стабильных локальных конформаций в неупорядоченных белках, что повышает достоверность определения мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию за счет критериев отбора вспышек, основанных на порогах скорости потока фотонов и наносекундной фильтрации.
- Стратегическая ценность: Улучшает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), выявляя переходные структурные состояния, которые могут влиять на склонность к агрегации или аффинность связывания.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с поправкой на риск путем идентификации конформационных субпопуляций, связанных с функциональными состояниями, такими как связывание с мембраной.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области одномолекулярной флуоресцентной спектроскопии и анализа фотонных вспышек.
- Необходимо оборудование с возможностью детектирования с временным разрешением, включая импульсные лазеры и детекторы, совместимые с TCSPC.
- Требуется межгрупповая стандартизация порогов отбора вспышек и протоколов анализа гистограмм.
- При применении метода к другим сайтам мечения или белковым системам, помимо остатка 56 α-synuclein, необходимо учитывать особенности адаптации.
- Метод ограничен необходимостью получения достаточного количества фотонов в каждой вспышке для точного расчета среднего времени жизни флуоресценции и исключения смещения из-за фона.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:48
Single-Molecule Protein-Induced Fluorescence Enhancement (smPIFE) Sample Preparation and Data Acquisition
2:19
smPIFE Burst Analysis
5:07
Results: Estimation of Mean Fluorescence Lifetime and Burst Recurrence Analysis
7:12
Conclusion
